心血管疾病是当今世界造成死亡的最主要原因之一，2013年全球疾病负担研究估计心血管疾病导致的死亡人数约占总死亡人数的30%^［1］，预计到2030年心血管疾病死亡人数将高达2 300万人^［2］。在我国心血管疾病造成的死亡率高达42%，目前估计全国共有心血管疾病患者2.9亿^［3-4］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的病理基础，其发病机制非常复杂^［5］，目前尚不明确，因此尚无有效的根治方法，所以其预防及减缓显得尤为重要。随着医疗保健水平的提高，越来越多的具有抗AS作用的天然活性成分如木酚素^［6］、绿原酸^［7］和芎芍^［8］等被相继开发出来，以此为原料的功能性食品也相继问世，对这些功能性食品的抗AS功效进行评价需要建立并选择合适的动物模型。目前用于建立AS模型的动物有大鼠、小鼠、猪、兔和灵长类动物等，其中猪类和猴类能够形成最接近于人类的AS病理特点，但是由于其个体大、成本高、造模时间长以及遗传研究困难等使其应用受到了限制^［9］。兔类可由高脂和酪蛋白等不规则膳食诱导产生AS，而且高脂虽然能够诱导泡沫细胞产生，但是诱导AS晚期病变所需时间较长，而长期的高脂饮食诱导大量炎症反应和肝脏毒性，引起兔死亡率增加，而且这种大量炎症反应与人类AS的慢性炎症反应的发病机制相差较大^［10］。而鼠类由于成本低、易于繁殖、基因操作方便以及能够定期监测AS等优点，是应用最多的动物模型^［9］。本研究主要以SD大鼠和ApoE基因敲除（ApoE^-/-）小鼠为研究对象建立AS模型，并通过相关生理指标检测选择最优的动物模型。
        正常基础饲料和AS模型饲料均购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司［许可证号：苏饲证（2014）01008］。饲料配方见表1。
        60只8周龄雄性SD大鼠（225～250 g）、40只8周龄ApoE^-/-雄性小鼠和20只相同遗传背景下野生型雄性8周龄C57BL/6小鼠（10～15 g），均购自于北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2012-0001］。所有动物饲养于华中科技大学同济医学院SPF屏障系统［许可证号：SYXK
        （鄂）2010-0028］。试验期间所有动物分笼饲养，其中大鼠每笼3只，小鼠每笼1只，室温(22±2) ℃，相对湿度50%～60%，自然昼夜节律，自由进食、饮水，试验周期为6个月。
        1575洗板机（美国Bio-Rad）、Enspire酶标仪（美国PerkinElmer）、GT-X980扫描仪（日本Epson）。维生素D3、油红O和多聚甲醛均购自美国Sigma，甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒均购自南京建成生物科技有限公司，白介素6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）酶联免疫吸附测定试剂盒均购自美国Abcam。
        所有动物饲喂正常基础饲料，适应性喂养7 d后，根据体质量随机分组，每组20只。
        对照组1为正常SD大鼠饲以正常基础饲料；模型组1为正常SD大鼠饲以AS饲料；模型组2为正常SD大鼠，试验开始时，将维生素D3溶于精炼植物油，一次性腹腔注射（600 000 IU/kg），然后饲以AS模型饲料。
        对照组2为正常C57BL/6小鼠饲以正常基础饲料；模型组3为ApoE^-/-小鼠饲以正常基础饲料；模型组4为ApoE^-/-小鼠饲以AS模型饲料。
        试验6个月后，各组动物禁食不禁水12 h，异氟烷麻醉，小鼠眼眶静脉丛取血，大鼠心脏取血，4 ℃下3 500 r/min离心15 min，分离血浆，-80 ℃保存备用。
        试验期间每周称1次动物体质量和剩食量，并作好记录，观察生理状况，记录动物存活情况。
        试剂盒酶法测定血浆TC、TG、LDL-C和HDL-C。
        采用酶联免疫吸附试剂盒测定CRP和IL-6，操作过程严格按照说明书进行。
        每组随机取3只动物，以1%戊巴比妥钠（5 ml/kg）麻醉。打开胸腔后，用等渗生理盐水进行快速左心室灌注，冲净全身血液。待右心耳流出液体澄清时，将心脏、血管及肾脏留于原位。在体视显微镜下分离主动脉弓，沿脊柱前缘使用微型手术器械轻柔分离主动脉组织，小心剥离血管周围的脂肪组织，之后分离出整根主动脉（从与心脏连接处至双侧髂总动脉分支处）。使用微型剪刀插入主动脉管腔并纵向剪开整根血管，使整根血管的内壁充分暴露。用70%乙醇轻轻冲洗5 min，待乙醇挥发后，将整根血管浸入油红O溶液15 min，80%乙醇溶液分化，然后进行图像扫描。
        将主动脉固定于4%的多聚甲醛溶液，包埋切片，进行圆管腔和主动脉根部苏木精-伊红（HE）染色。
        体质量数据以平均数表示，其他数据均以平均数±标准差（±s）表示。采用SPSS 13.0软件对结果进行分析，采用单因素方差分析，用Fisher PLSD进行显著性差异检测。P＜0.05为差异有统计学意义。 
        如图1所示，各组大鼠初始体质量差异无统计学意义（P＞0.05），对照组1和模型组1大鼠的体质量随喂养时间的增长而呈现递增的趋势。模型组2大鼠的体质量在第1周开始即低于对照组1和模型1，并且在以后持续降低，在第5周达到最低点。虽然之后体质量逐渐恢复，但到试验结束时仍然明显低于对照组1和模型组1。另外，维生素D3处理导致模型组2大鼠组的体质量明显增大，差异有统计学意义（P＜0.05），同时导致数只大鼠死亡。
        如图2所示，模型组3和模型组4小鼠初始体质量差异无统计学意义（P＞0.05），对照组2小鼠的体质量稍高，但三组间差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组2与模型组3小鼠的体质量随喂养时间的增长而出现递增的趋势，模型组4小鼠从第13周开始体质量明显高于C57BL/6对照小鼠，差异有统计学意义（P＜0.05），并保持到试验结束。
        如表2所示，与对照组1比较，模型组1和模型组2大鼠的血浆TC明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；但血浆TG、LDL-C和HDL-C没有明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）。
        如表3所示，与对照组2比较，模型组3和模型组4小鼠的血浆TC、TG和LDL-C均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组4小鼠血浆HDL-C明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且模型组4的血浆TC和LDL-C水平明显高于模型组3，差异有统计学意义（P＜0.05）。
        如表4所示，与对照组1大鼠比较，模型组1和模型组2大鼠的血浆炎症因子IL-6和CRP均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。
        如表5所示，与对照组2比较，模型组3和模型组4动物的血浆IL-6和CRP均明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）；并且模型组4的血浆IL-6和CRP水平明显高于模型组3，差异有统计学意义（P＜0.05）。
        如图3所示，所有组别的大鼠主动脉油红O染色均未见明显的脂质沉积和脂质斑块。圆管腔和三尖瓣HE染色（见图4、5）可见所有组别内膜完整，未见泡沫细胞聚集，未见AS病变形成。注：A为对照组1；B为模型组1；C为模型组2
        小鼠主动脉油红O染色（见图6）的结果表明：对照组2小鼠的主动脉未见脂质沉积现象，模型组3仅见少量的脂质沉积，而模型组4的主动脉可见极为明显的AS斑块，并且以主动脉弓和下腹部主动脉最为明显。小鼠主动脉圆管腔和主动脉根部HE染色（见图7、8）也显示对照组2小鼠成正常的管腔结构，内膜完整，未见泡沫细胞聚集，未见AS病变；模型组3的管腔内膜不完整，有少量的动脉粥样硬化斑块沉积，有少量的泡沫细胞。而模型组4的管腔可见血管壁明显增厚，内膜完整性破坏，内膜下有大量泡沫细胞浸润，形成明显的AS斑块。
        选择合适的动物模型是进行功能性食品抗AS功效评价的重要前提，本研究主要在总结前人经验的基础上选择SD大鼠和ApoE^-/-小鼠，建立AS模型。
        研究表明钙离子可以作为平滑肌细胞的迁移和增殖以及细胞外基质分泌过程中的第二信使，促进AS的发展^［11］。过量维生素D能够引起血钙升高，破坏动脉内膜完整性，诱导炎症细胞和脂质的聚集^［12］。本研究主要采用高脂和高脂+维生素D3联合诱导建立模型组1和模型组2大鼠AS模型。Aubin等^［13］采用高脂喂养SD大鼠8周后，其血浆TC、LDL-C、HDL-C和TG没有明显变化，这与本研究中模型组1大鼠血浆LDL-C、HDL-C和TG变化一致，但是模型组1大鼠血浆TC水平明显升高，可能与喂养时间较长有关系。有研究学者指出单纯的高脂饲料无法诱导大鼠AS产生，这在本研究中也得到证实。PANG等^［14］采用7 000 000 IU/kg剂量的维生素D3连续灌胃4 d并以由4%胆固醇、1%胆酸、0.5%丙基硫氧嘧啶以及色拉油制成的乳剂连续喂养SD大鼠3个月后，SD大鼠主动脉内膜有明显的脂质沉积和AS斑块形成，其血浆TC、LDL-C水平明显升高。温进坤等^［15］采用相同剂量的维生素D3连续灌胃3 d，并用含1%胆固醇、0.35%胆酸、5%猪油和0.61%丙基硫氧嘧啶的高脂饲料连续喂养SD大鼠21 d，结果大鼠主动脉出现内膜增生和脂质沉积、中膜平滑肌细胞增殖等AS病变。赵娟等^［16］采用7 000 000 IU/kg剂量的维生素D3大鼠腹腔注射3次联合高脂饲料喂养4周，成功快速地复制了大鼠AS模型。本研究中采用一次性腹腔注射6 000 000 IU/kg维生素D3联合高脂饲料喂养SD大鼠6个月后，未能产生明显的AS病变，而且大剂量的维生素D3导致大鼠死亡率升高，体质量大幅度降低，组内个体差异增大，表明该方法可能不能建立稳定的SD大鼠AS模型，因此模型组2不适合用作AS研究的对象。
        早在1992年，Plump等^［17］成功建立了ApoE^-/-小鼠AS模型并发现含4.5%脂肪的常规饲料即诱导ApoE^-/-小鼠AS病变。刘剑刚等^［18］分别采用普通饲料和高脂饲料诱导ApoE^-/-小鼠AS模型，并分别研究15、19、24、28和36周龄ApoE^-/-小鼠AS发展情况，结果表明随着时间的推移ApoE^-/-小鼠AS程度逐渐加重，经历了从脂肪条纹到斑块形成的AS病理过程，但高脂组ApoE^-/-小鼠AS病变程度严重。现在，ApoE^-/-小鼠已经被广泛应用于各种AS相关研究^［19-21］。本研究中，模型组3和模型组4动物的血浆TC、TG和LDL-C均明显增高，模型组4动物的血浆HDL-C明显降低，并且模型组4的血浆TC和LDL-C水平明显高于模型组3，差异均有统计学意义（P＜0.05）。模型组3和模型组4的血浆炎症因子IL-6和CRP均明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05），但模型组4增加更为明显。此外，模型组3小鼠仅出现部分AS模型特点，而模型组4则发展为典型AS病理特点，而且在整个生长过程中体质量增长趋势平稳，个体间差异较小，适合作为AS研究的对象。