DOi:10.13590/j.cjfh.2017.01.008
腰果主要过敏原Ana o 3的重组表达与鉴定
闫娟娟1,佘钿田1,张嘉懿2,边颖1,李会强1

(1.College of Medical Laboratory,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China; 2.Department of Medical Laboratory, Tianjin Childrens Hospital, Tianjin 300074, China)

作者简介: 闫娟娟女硕士研究方向为食物过敏实验诊断 E-mail:13502190375@163.com 通信作者: 李会强男教授研究方向为食物过敏实验诊断及相关技术E-mail:lihuiqiang1965@163.com

收稿日期: 2016-11-06

基金项目: 天津医科大学校基金面上项目(2014KYM08)

摘要:目的 克隆获得腰果主要过敏原Ana o 3基因,并利用pCold-SUMO原核表达载体重组表达Ana o 3并鉴定免疫活性。方法提取腰果总RNA,逆转录至cDNA,设计特异性引物,通过巢式PCR技术克隆腰果Ana o 3基因,将其插入pCold-SUMO vector,鉴定并测序;将测序正确的阳性质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),低温15 ℃诱导表达。摸索诱导表达条件,经镍柱纯化,并通过Western blot鉴定免疫活性。结果测序结果表明,克隆腰果Ana o 3基因片段全长为417 bp,与GenBank上Ana o 3基因CDS序列基本一致;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,目的蛋白分子量为27 kD左右,大小与理论值相符;Western blot结果表明,与腰果过敏阳性血清具有良好的反应性。结论从腰果中成功克隆了Ana o 3基因,并于原核系统表达了Ana o 3蛋白,证实了此蛋白与腰果过敏血清具有良好的反应性。
关键词: 腰果; Ana o 3; 基因克隆; 重组; 表达; 过敏原; 免疫印迹; 食品安全
中图分类号: R155     文献标识码:A     文章编号:1004-8456(2017)01-0037-05
Prokaryotic expression and identification of recombinant cashew nut allergen Ana o 3
YAN Juan-juan1, SHE Tian-tian1, ZHANG Jia-yi2, BIAN Ying1, LI Hui-qiang1

(1.College of Medical Laboratory,Tianjin Medical University,Tianjin 300203,China; 2.Department of Medical Laboratory, Tianjin Childrens Hospital, Tianjin 300074, China)

Abstract:Objective To clone and express an important cashew nut allergen Ana o 3 in Escherichia coli (E.coli)using pCold-SUMO expression vector and identify its immunocompetence.MethodsTotal RNA was extracted from the cashew nut and reverse transcribed into cDNA. Then, the full-length cDNA sequence of Ana o 3 was amplified by nested polymerase chain reaction (PCR) using specific primers, and subsequently inserted into the pCold-SUMO expression vector between StuⅠand BamHⅠ restriction sites. The correct construct was identified by both colony PCR and gene sequencing. The inducible expression of Ana o 3 was performed at 15 ℃ by an addition of L- ( + ) -arabinose and isopropyl b-d-thiogalactoside (IPTG), and the purification of the recombinant His-tagged protein was accomplished by the Ni-NTA purification system. The immunocompetence of the recombinant Ana o 3 was evaluated by Western blot. ResultsDNA sequencing analysis showed that the full length of Ana o 3 was 417 bp, encoding a polypeptide of 138 amino acids which was in accordance with that in GenBank. Also, the sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis result indicated the molecular weight of the recombinant Ana o 3 was 27 kD, which was in agreement with the theoretical value. Additionally, Western blot results showed that the recombinant Ana o 3 had good reactivity with 13 cases of cashew-allergic serum samples.ConclusionA recombinant expression vector of Ana o 3 had been successfully constructed, and the purified recombinant protein exhibited good reactivity with cashew-allergic sera.
Key words:  Cashew nut; Ana o 3; gene clone; recombination; expression; allergen; Western blot; food safety
        腰果过敏是一种常见的坚果类过敏,甚至成为影响人类健康的危险因素之一[1]。流行病学研究发现,欧美等发达国家坚果类过敏的患病率高达1.4%[2],坚果类食物中腰果过敏的发病率为15%~30%[3];而在我国无锡地区,陈国千等[4]用德国Mediwiss过敏原检测系统检出儿童腰果过敏阳性率为19%。腰果过敏是由IgE介导的变态反应,可引起皮肤、呼吸道和胃肠道症状,严重时可导致过敏性休克,且危及生命[5]。食物过敏原特异性IgE(sIgE)检测是诊断食物过敏的重要方法之一,分子诊断是sIgE检测的重要趋势。分子诊断强调以单一组分为已知抗原,替代食物蛋白提取液(混合蛋白),分别检测待检血清中sIgE,减少彼此干扰,有效提高sIgE检测的准确性[6]。目前,已明确的腰果过敏组分有3种,即Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3。Ana o 1为50 kD,7S的豌豆球蛋白;Ana o 2为33 kD,11S的球蛋白;Ana o 3为12.6 kD,2S的白蛋白[7]。研究报道,3种重组过敏原与腰果过敏阳性血清特异性IgE结合频率依次为50%、62%和93%[8-10]。天然过敏原提取困难,且蛋白容易降解,难于标准化[11]。因此,本研究通过构建Ana o 3重组质粒并以大肠埃希菌(Escherichia coli)作为表达宿主,近而获得可溶性好、表达量高、免疫活性强的重组Ana o 3,为实现腰果sIgE分子诊断提供优质抗原。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品及血清来源
        新鲜腰果购自天津世纪联华超市,腰果过敏阳性血清、阴性血清由天津市儿童医院提供。
        腰果过敏阳性病例共13例(见表1),临床诊断依据包括:典型的临床过敏史,血清总IgE>100 kU/L,腰果sIgE>0.35 kUA/L等。阴性对照血清1例,来自无任何过敏史的健康体检人群。
表1腰果过敏阳性病人临床资料
Table 1Clinical characteristics of cashew-allergic patients
1.1.2主要仪器与试剂
        水平摇床,PCR仪、Mini-PROTEAN 3垂直板型电泳仪、Mini Trans-Blot电转印槽、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad,Nano Drop 2000c分光光度计(美国Thermo scientific)。
        Escherichia coli Top 10感受态细胞、Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞、原核表达载体pCold-SUMO vector、Trizol、总RNA提取试剂盒、逆转录第一链合成试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、快速DNA产物纯化回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒、Trans2K plusII DNA Marker、Q5 Hot start DNA pol、Pfu DNA聚合酶、Taq酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶StuⅠ、BamHⅠ均购自大连宝生物公司,镍柱(德国Invitrogen),辣根过氧化物酶(HRP)底物(美国Millipore), 鼠抗人IgE-HRP(美国Sigma), 氨苄青霉素、L-阿拉伯糖、丙基-β-D-硫代吡喃半乳(IPTG)、细菌裂解液(1% Triton-X100,1 mmol/L溶菌酶,0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐缓冲液)等试剂均购自上海生工生物工程股份有限公司,特异性引物也由其合成。
1.2方法
1.2.1Ana o 3基因的克隆
        取腰果植物组织样品,按照Trizol说明进行总RNA提取,利用Nano Drop 2000c分光光度计进行纯度分析。然后逆转录PCR(RT-PCR)获得腰果cDNA。根据GenBank中Ana o 3的核酸序列(AY081853.1),设计巢式引物(见表2),通过巢式PCR(Nested PCR)技术获得Ana o 3目的基因。
表2巢式PCR引物序列
Table 2Primer sequences for nested PCR
注:下划线为酶切位点
1.2.2表达载体pCold-SUMO-Ana o 3的构建
        将获得的Ana o 3基因与pCold-SUMO质粒进行StuⅠ和BamH I双酶切,T4 DNA连接酶将回收产物相互连接,即得重组质粒。将重组质粒转入Escherichia coli Top10,涂布含有氨苄青霉素的LB培养基(100 μg/ml)进行抗氨苄青霉素筛选,挑取单个菌落进行菌落PCR,设置空载对照,鉴定片段大小并测序。
1.2.3重组蛋白的诱导表达
        将测序正确的菌株进行质粒提取,转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)。将含有重组质粒的表达菌株,接入LB培基(L-阿拉伯糖0.5 mg/ml、氨苄青霉素100 μg/ml),扩大培养至600 nm吸光度(OD600)为0.4~0.6时,15 ℃静置30 min。留取一部分菌液为未诱导,剩余进行15 ℃分管诱导,9 000 r/min离心5 min收集菌体,加入裂解液,冰上超声破碎。4 ℃、12 000 r/min离心5 min,收集上清,检测IPTG终浓度(0.5、1 mmol/L)、诱导时间(3、24 h)对Ana o 3可溶性表达量的影响。设置pCold-SUMO空载质粒及Escherichia coli BL21(DE3)空菌为蛋白表达阴性对照。最后用12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白表达情况。
1.2.4重组蛋白的纯化
按照最优表达条件扩大蛋白表达量,获取细菌裂解上清。因重组蛋白带有His标签,采用Ni-NTA进行目的蛋白提纯。首先,在柱子中加入Ni-NTA和不含咪唑的Binding Buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,pH=8.0)进行镍柱平衡;然后加入细菌裂解上清4 ℃慢摇1 h,使目的蛋白与镍柱进行充分结合;为了去除未结合蛋白,加入含低浓度咪唑的Wash Buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,咪唑20 mmol/L);最后加入含高浓度咪唑的Elution Buffer(50 mmol/L NaH2PO4,500 mmol/L NaCl,咪唑250 mmol/L)洗脱亲和柱,收集洗脱液,SDS-PAGE检测纯化结果。最终,用Nano Drop 2000c分光光度计检测蛋白浓度。
1.2.5重组蛋白的免疫活性鉴定
        采用Western blot将重组Ana o 3抗原转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,条件为:70 V恒压1.5 h;加入5%脱脂牛奶封闭,室温慢摇2 h;TBST洗3次,10 min/次,将13例腰果过敏阳性血清及阴性对照血清分别1∶10稀释至1 ml,4 ℃慢摇过夜;洗涤,加入1∶7 500稀释的鼠抗人IgE-HRP,室温孵育1 h;洗涤,最后加入HRP化学发光底物,反应3 min,曝光。 
2结果
2.1Ana o 3 基因克隆结果
        巢氏PCR第一轮扩增出目的片段,经琼脂糖凝 胶电泳后,在约480 bp处有一条亮带,与理论预测 大小487 bp相符,见图1A;以第一轮PCR产物为模板,在第二对引物的作用下扩增出目的片段,与理论预测大小一致(436 bp),见图1B。
    
注:A图中M为Marker,1为Ana o 3第一轮PCR产物;
B图中M为Marker,1为Ana o 3第二轮PCR产物
图1腰果过敏原Ana o 3基因克隆
Figure 1Gene cloning results of cashew nut allergen Ana o 3
2.2重组质粒pCold-SUMO-Ana o 3的构建及鉴定
        Ana o 3基因产物及pCold-SUMO载体经酶切、连接后,构建重组表达载体pCold-SUMO-Ana o 3,构建简图见图2。空载pCold-SUMO及重组表达载体pCold-SUMO-Ana o 3分别进行菌落PCR,琼脂糖凝胶电泳见图3,可以看出泳道2重组质粒与泳道1空载相差约400 bp左右,表明大小与预测的理论值
图2Ana o 3基因表达质粒的构建
Figure 2Construction of recombinant plasmid pCold-SUMO-Ana o 3、

        2为pCold-SUMO-Ana o 3重组质粒
图3重组质粒pCold-SUMO-Ana o 3菌落PCR鉴定
Figure 3Identification of recombinant plasmid 
pCold-SUMO-Ana o 3 by Colony P
注:M为Marker;1为pCold-SUMO空载;
        417 bp相符。将该阳性菌株进行测序(见图4),结果表明与GenBank上Ana o 3基因编码序列基本一致(99.5%,415/417),最终编码出的氨基酸序列完全相同。
2.3重组Ana o 3的诱导表达
图5A中SDS-PAGE结果表明,与空菌(1)、空
图4阳性菌株测序结果与Ana o 3的编码序列比对分析
Figure 4Sequence analysis of positive strains and 
Ana o 3 in GenBank
        载(2)、未诱导(3)阳性菌相比,阳性菌(4)经IPTG 诱导后,明显多出一条带,约27 kD。由于SUMO标签约15 kD,编码的Ana o 3蛋白约12.6 kD,所以融合蛋白理论值为27.6 kD,与电泳显示条带大小一致;Ana o 3 蛋白于上清(5)和沉淀(6)中均存在,且上清中目的蛋白含量明显多于沉淀。初步摸索上清中可溶性蛋白的诱导表达条件,图5B可见诱导表达浓度0.5、1 mmol/L差别不明显,0.5 mmol/L效果稍好;诱导时间3 h与24 h相比,无明显差别,因此,选择3 h进行大量表达。
注:A图为重组Ana o 3的表达及分布情况;M为Marker;1为空菌株(BL21);2为空载体(pCold-SUMO);3为未诱导菌体蛋白;
4为诱导后菌体蛋白;5为诱导后菌体裂解上清;6为诱导后菌体裂解沉淀(3~6为阳性菌株);B图为重组Ana o 3的诱导表达条件优化;
M为Marker;1为IPTG终浓度1 mmol/L诱导24 h;2为IPTG终浓度0.5 mmol/L诱导24 h;3为IPTG终浓度0.5 mmol/L诱导3 h
图5Ana o 3重组蛋白诱导表达情况
Figure 5Inducible expression of recombinant protein Ana o 3
2.4重组Ana o 3的纯化结果
        由于pCold-SUMO冷休克表达载体含有6个His标签,采用镍柱纯化,图6为纯化后的结果,箭头所指为目的条带,电泳扫描显示目的条带比例约占70%左右,经紫外吸收测定,蛋白浓度为0.7 mg/ml。
注:M为Marker;1为Ana o 3重组蛋白镍柱纯化产物
图6镍柱纯化Ana o 3重组蛋白的电泳结果
Figure 6SDS-PAGE analysis of the purified recombinant 
protein Ana o 3 by Ni-NTA
2.5重组Ana o 3免疫活性鉴定
        纯化蛋白免疫印迹结果如图7所示,显示腰果过敏阳性血清中除10号阳性血清外,其他均与重组蛋白显示不同强度的结合,阴性血清未显示特异性结合。此结果说明重组蛋白与腰果过敏阳性sIgE具有良好的反应性。
注:M为Marker;1~13为腰果过敏阳性血清;N为阴性血清
图7重组Ana o 3的Western blot结果
Figure 7Western blot analysis of recombinant Ana o 3
3讨论
        腰果过敏作为一种较常见的食物过敏,其发病率高,引起的后果严重,过敏伴随持久[12]。腰果过敏原Ana o 3分子量小,相对含量少,提取天然Ana o 3纯品较为复杂,且批间差异较大。然而,Ana o 3作为2S白蛋白,可抵抗胃肠道的消化作用[13],进而引起过敏的发病率高,因此过敏原Ana o 3特异性IgE检测具有重要意义。
        pCold-SUMO是一种新型的冷休克原核表达载体[14],其SUMO标签具有抗蛋白酶水解、增加小分子量蛋白表达量等功能,而表达所用的15 ℃低温又可使蛋白合成速度减慢,从而促进靶蛋白正确折叠、提高蛋白可溶性表达等[15]。然而,表达过程中仍不可避免的会有包涵体的形成,本研究中上清与沉淀比例约为3∶2,这与陈春丽等[16]表达的SUMO-dCap分布比例相一致。镍柱纯化后,除目的条带外,其余两条含量较少的小片段可能为纯化时洗涤不彻底所致。
        本研究选用13例腰果过敏阳性病例血清作为识别抗体,检测纯化的重组蛋白与其特异性结合能力,结果发现重组Ana o 3与10例腰果过敏阳性血清反应较强,说明重组Ana o 3具有较好的免疫活性。但重组Ana o 3与其他3例腰果过敏血清反应较弱或者无反应,说明少部分腰果过敏阳性血清中不含针对Ana o 3过敏组分的抗体。对比临床资料,发现蛋白免疫印迹结果与腰果sIgE浓度并未成良好的线性关系,可能因为临床检测腰果sIgE所用的抗原为腰果混合组分(Ana o 1、Ana o 2、Ana o 3),而本研究的检测抗原为腰果Ana o 3。本次重组Ana o 3对于腰果单组分研究具有重要意义,不仅可为腰果sIgE检测提供优质原料,同时为腰果过敏原sIgE的分子诊断创造条件。
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