DOi:10.13590/j.cjfh.2017.01.011
Baird-Parker琼脂上被抑制的金黄色葡萄球菌的筛选与特征研究
于海瑶1,2,骆海朋2,任秀2,张庆生2,丁宏2,孟庆群1,王玉杰1,雷晓利1,崔生辉2

(1.吉林省长春市食品药品检测中心,吉林 长春130012; 2.中国食品药品检定研究院,北京100050)

作者简介: 于海瑶女助理工程师研究方向为食品微生物检测E-mail:yuhaiyao11@126.com
通信作者: 崔生辉男研究员研究方向为食品微生物学E-mail:cuishenghui@aliyun.com

收稿日期: 2016-08-08

基金项目: 北京市科学技术委员会基金课题(D161100002116003)

摘要:目的 对在Baird-Parker琼脂平板上被抑制的金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)的遗传特征进行深入研究,并提出针对性检验措施。方法通过对127株不同来源的金葡菌和8株金葡菌标准菌株在Baird-Parker琼脂平板上进行测试,筛选在Baird-Parker琼脂平板上被抑制的金葡菌,并对菌株的遗传特征进行分析,同时检测Baird-Parker琼 脂平板中的抑菌成分对金葡菌的抑制作用。结果3株分离自北京猪肉馅中的菌株和金葡菌标准菌株(CMCC 26112)在Baird-Parker琼脂上生长率低于万分之一,Baird-Parker琼脂基础培养基中添加甘氨酸(12.0 g/L)可明显抑制这4株金葡菌的生长,而六水合氯化锂(5.0 g/L)、丙酮酸钠(10.0 g/L)和卵黄亚碲酸钾(50 ml)的添加对这4株金葡菌的生长没有明显影响;这4株菌在高盐甘露醇琼脂和科马嘉显色平板上的生长率均高于60%;脉冲场电泳(PFGE)分析发现,北京来源的3株金葡菌为同一PFGE型别,与标准菌株(CMCC 26112)存在明显差异。结论为保证食品安全国家标准检验方法GB 4789.10—2010对不同金葡菌计数的覆盖性,计数检验过程中应使用两种或两种以上金葡菌选择性平板。
关键词: 金黄色葡萄球菌; Baird-Parker琼脂; 计数; 生长抑制; 筛选; 特征; 检验方法
中图分类号: R155     文献标识码:A     文章编号:1004-8456(2017)01-0051-05
Screening and characterization of Staphylococcus aureus isolates inhibited o
Baird-Parker agar
YU Hai-yao1,2, LUO Hai-peng2, REN Xiu2, ZHANG Qing-sheng2, DING Hong2,  MENG Qing-qun1, WANG Yu-jie1, LEI Xiao-li1, CUI Sheng-hui2

(1.Jilin Province Inspection Center for Food and Drug,Jilin Changchun 130012,China; 2.National Institute of Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Abstract:Objective To characterize the Staphylococcus aureus(S.aureus) isolates that were inhibited on Baird-Parker agar and propose the possible solutions for the enumeration of these isolates.MethodsThe isolates inhibited on Baird-Parker agar were identified from 127 S.aureus isolates from different sources and eight S.aureus reference strains. The characteristics of these isolates were analyzed and the inhibitory effects of the components in Baird-Parker were determined. ResultsThree S.aureus isolates from the ground pork samples in Beijing and a reference strain S.aureus (CMCC 26112) showed poor growth on Baird-Parker agar. The glycine (12.0 g/L) in the Baird-Parker agar could inhibit the growth of these four isolates, and the supplement of sodium pyruvate, lithium chloride and egg yolk potassium tellurite didnt inhibit the growth of these isolates. These four isolates showed over 60% growth rate on mannitol salt agar and chromogenic agar. The pulsed field gel electrophoresis (PFGE) showed that three isolates from Beijing had the same PFGE pattern which was significantly different from the pattern of (CMCC 26112).ConclusionTo guarantee the good coverage of the national food safety standard GB 4789.10-2010 on S.aureus, two or more categories of agar plates should be used in the S.aureus enumeration of food samples.
Key words: Staphylococcus aureus; Baird-Parker agar; enumeration; growth inhibition; screening; characterization; test method
         金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)是世界范围内引起社区人群食物中毒的重要食源性病原菌之一,该菌多是通过养殖、种植、屠宰、加工等环节的交叉污染,进入食品生产企业、餐饮单位和家庭厨房等场所伺机污染即食食品,并在适宜条件下产生金葡菌肠毒素而引起个体发病。鉴于金葡菌是全球食物中毒暴发最为常见的致病菌之一[1-2],2013年实施的GB 29921—2013 《食品安全国家标准 食品中致病菌限量》[3]中,对金葡菌在11类食品中的污染限量均进行了规定,且在该标准中指定金葡菌的检测方法为GB 4789.10—2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》[4]中的第二法。在GB 4789.10—2010第二法中,直接通过将食品均质液涂布于Baird-Parker琼脂平板上进行培养计数,而后用血浆凝固酶试验对可疑菌落进行确认。虽然Baird-Parker琼脂用于金葡菌的检测已有数十年的历史[5-7],是目前大量国际规范中常用的金葡菌检测用培养基,但金葡菌的种内构成极其复杂,即使在生化表型上,不同的金葡菌也存在很大的差异,仅仅依赖Baird-Parker琼脂平板法,难免会出现漏检的风险。鉴于GB 4789.10—2010是我国强制执行的食品安全国家标准检验方法,其特异性和灵敏度会严重影响不同种类食品安全检验结果的获取与应用,不同研究机构针对Baird-Parker琼脂在食品中金葡菌计数检验方法进行了深入的对比研究[8-9]
       本研究通过对不同来源收集的金葡菌在Baird-Parker琼 脂平板上的生长率进行分析,发现少数金葡菌菌株在该平板上几乎不能生长,并针对这些菌株的遗传特征进行了深入研究,提出针对这类菌株检验的实用措施。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
        本研究使用127株从北京、陕西、广东等地区肉馅中分离的金葡菌(见表1)和8株金葡菌标准菌株(CMCC 26112、 ATCC 29213、CMCC 26003、 ATCC 29213、 ATCC 26111、 NCTC 10708、 ATCC 25923和 CMCC 26079,均购自中国食品药品检定研究院)进行分析研究。
表1试验用金葡菌菌株信息
Table 1Information of Staphylococcus aureus strains for testing
1.1.2主要仪器与试剂
        恒温培养箱、全自动微生物螺旋加样系统(西班牙IUL)、恒温培养箱、高压灭菌器;胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基、水解酪蛋白(MH)培养基、Baird-Parker琼脂、胰蛋白胨、酵母粉、牛肉粉、卵黄亚碲酸钾、高盐甘露醇琼脂、琼脂均购自美国BD,科马嘉显色琼脂(郑州博赛公司),血浆凝固酶(北京三药科技开发公司),API Staphy ID鉴定条(北京威泰克公司),PCR检测用相关试剂(大连宝生生物科技有限公司),甘氨酸、氯化锂、丙酮酸钠,Sma I限制性内切酶(New England Biolab北京有限公司)。
1.2方法
1.2.1Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌的筛选 
        取127株不同来源金葡菌和8株标准菌株的新鲜MH平板培养物,用无菌生理盐水将培养物调成1.0 MCF菌悬液,并对菌悬液进行梯度稀释,选取浓度约为1.0×104 CFU/ml菌悬液作为待测液,用螺旋涂布仪分别在Baird-Parker琼脂和TSA平板上进行涂布,于36 ℃培养22~48 h后,按GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[10]中推荐方法计算不同菌株的生长率。
1.2.2Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌的确认
        对生长率不足0.7%的菌株用1.2.1方法重新测试进行确认,而后对筛选出的在Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌用血浆凝固酶、API Staphy ID鉴定条和PCR方法扩增nuc作进一步种属确认[11],将确认后的菌株均于-80 ℃储存备用。
1.2.3Baird-Parker琼脂中不同抑菌成分的筛选
        参照GB 4789.10—2010[4]中Baird-Parker琼脂培养基制备方法,以胰蛋白胨(10 g/L)、酵母粉(1.0 g/L)、牛肉粉(5.0 g/L)和琼脂(20 g/L)作为基础培养基,分别依次添加甘氨酸(12.0 g/L)、六水合氯化锂(5.0 g/L)、丙酮酸钠(10.0 g/L)和卵黄亚碲酸钾(50 ml),并调节pH至(7.0±0.2),制备测试用培养基。取1.2.2方法确认的在Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌新鲜MH平板培养物,按1.2.1方法测试不同菌株在不同测试培养基上的生长率。
1.2.4最低抑菌浓度(MICs)的测定
        参考CLSI 2015版推荐的肉汤和琼脂稀释法[12],测定在Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌菌株对Baird-Parker琼脂中不同抑菌成分的MICs值,质控菌株为金葡菌(ATCC 29213)。
1.2.5Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌特征分析
        依照1.2.1方法,对筛选出的在Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌在高盐甘露醇和金葡菌显色平板上进行生长率测试。参照文献[13]推荐的金葡菌脉冲场电泳(PFGE)分型的方法,用Sma I 限制性内切酶对所有在Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌进行分型,并将PFGE图像导入BioNumerics 4.0软件进行同源性聚类分析。
2结果
2.1Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌的筛选
        通过对127株不同来源的金葡菌和8株标准菌株进行测试,发现3株分离自北京猪肉馅中的菌株和金葡菌标准菌株(CMCC 26112)在Baird-Parker琼脂上生长率低于万分之一,其余131株菌在Baird-Parker琼脂上的生长率均高于10%,具体VITEK结果见表2。
    表2筛选出的被抑制菌株信息及VITEK检定结果
Table 2Detail of screened strains with low growth rate andthe corresponding VITEK results 
2.2Baird-Parker琼脂培养基中各组分对金葡菌生长的影响
        对4株在Baird-Parker琼脂培养基上被抑制金葡菌进行测试发现,Baird-Parker琼脂基础培养基中添加甘氨酸(12.0 g/L)可明显抑制这4株金葡菌的生长。通过测试发现,在Baird-Parker琼脂基础培养基中,甘氨酸对4株金葡菌的MICs值均为12.0 g/L。而六水合氯化锂(5.0 g/L)、丙酮酸钠(10.0 g/L)和卵黄亚碲酸钾(50 ml)的添加对这4株金葡菌的生长没有明显影响,见表3。表3Baird-Parker琼脂培养基中各组分对金葡菌生长的影响
        Table 3Effect of different components in Baird-Parker agar for the growth of Staphylococcus aureus注:*为由Baird-Parker琼脂的基础成分构成:胰蛋白胨(10 g/L)、酵母粉(1.0 g/L)、牛肉粉(5.0 g/L)和琼脂(20 g/L)
2.3Baird-Parker琼脂上被抑制金葡菌特征分析
        对4株在Baird-Parker琼脂培养基上被抑制金葡菌进行测试发现,4株菌在高盐甘露醇琼脂和科马嘉显色平板上的生长率均高于60%。通过对这4株菌进行PFGE分析发现,北京猪肉馅来源的3株金葡菌FC 3405、FC 3407、FC 3408为同一PFGE型别,其PFGE图谱与标准菌株(CMCC 26112)存在明显差异,见图1。
图1北京猪肉馅来源的3株金葡菌与标准菌株的
PFGE图谱
Figure 1PFGE profiles of a standard strain and three 
strains of Staphylococcus aureus from pork samples in Beijing
3讨论
        本研究通过对127株不同来源的金葡菌和8株标准菌株进行测试,发现3株分离自北京猪肉馅中的菌株和金葡菌标准菌株(CMCC 26112)在Baird-Parker 琼脂上生长率低于万分之一,分析Baird-Parker琼脂的组分,发现这一抑制作用是由于甘氨酸(12.0 g/L)浓度达到这4株菌的MICs值造成的,但4株菌在高盐甘露醇琼脂和科马嘉显色平板上的生长率均高于60%。本研究结果对未来GB 4789.10—2010标准的修订提供了有力的数据支持。
        近年金葡菌分子流行病学的研究显示,金葡菌的种内构成极其复杂,目前已识别的多位点序列分型有两千余个(http://saureus.mlst.net/)[14],即使在生化表型上,不同的金葡菌也存在很大差异。作为一个强制性的食品安全国家标准检验方法,GB 4789.10—2010仅使用一种金葡菌选择性培养基进行食品中金葡菌计数检验的准确性亟待深入验证。在本研究中,Baird-Parker琼脂用于金葡菌的检测就有2.96%的假阴性率。张琳等[15]亦发现,即使Baird-Parker平板上的典型菌落,其血浆凝固酶阳性率也仅为66%,而当非金葡菌浓度过高时,目的菌可能被覆盖而难以计数,使检测难度增加,并且也加大了漏检导致公共卫生事件暴发的风险。本研究中发现4株金葡菌可被Baird-Parker琼脂明显抑制,这进一步说明金葡菌种内的复杂性,而这4株菌 在高盐甘露醇琼脂和科马嘉显色平板上均生长良好。
    作为金葡菌选择性计数平板,Baird-Parker琼脂中的蛋白胨、牛肉提取物和酵母提取物为微生物生长提供了氮源、碳源等必要营养,丙酮酸钠在不破坏培养基选择性的前提下可刺激金葡菌的生长,而亚碲酸钾、甘氨酸和氯化锂为该琼脂中的选择性成分。本研究显示,Baird-Parker琼脂中甘氨酸的使用浓度(12.0 g/L)可抑制4株金葡菌的生长。文献报道显示[16-17],甘氨酸是通过干扰细胞壁的合成而抑制微生物的生长,虽然金葡菌对甘氨酸较其他微生物耐受能力较强,但过高的浓度仍可抑制金葡菌生长。本研究结果显示,由于金葡菌种内遗传分类的多样性,该种内存在少量菌株对甘氨酸较为敏感,在Baird-Parker琼脂中甘氨酸的使用浓度(12.0 g/L)条件下生长被抑制。通过PFGE分析显示,这类菌株并非单独的一个克隆,而是有不同的遗传背景。但这类菌株的共同特点是可在不同于Baird-Parker琼脂上,诸如高盐甘露醇琼脂和科马嘉显色平板上生长良好。以上结果提示在食品中金葡菌计数检测时,为保证国标方法对金葡菌计数检出的广泛性,应使用配方原理不同的两种或两种以上选择性平板对金葡菌进行计数检验。
        综上,本研究结果明确指出食品安全国家标准GB 4789.10—2010中使用单一选择性计数平板对食品中金葡菌进行检验存在明显的漏洞。为保证GB 4789.10—2010对不同金葡菌计数的覆盖性,计数检验过程中应使用两种或两种以上金葡菌选择性平板。本研究结果对未来食品安全国家标准GB 4789.10—2010中金葡菌计数方法的修订提供了有力的数据支持。
参考文献
[1]Harker K S,Lane C,Gormley F J,et al.National outbreaks of Salmonella infection in the UK,2000-2011[J].Epidemiology and Infection,2014,142(3):601-607.
[2]Laufer A S,Grass J,Holt K,et al.Outbreaks of Salmonella infections attributed to beef-United States, 1973-2011[J].Epidemiology and Infection,2015,143(9):2003-2013.
[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 29921—2013 食品安全国家标准 食品中致病菌限量[S].北京:中国标准出版社,2013.
[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.10—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验[S].北京:中国标准出版社,2010.
[5]Mitchell R G.Classification of Staphylococcus albus strains isolated from the urinary tract[J].Journal of Clinical Pathology,1968,21(1):93-96.
[6]Devoyod J J,Millet L,Mocquot G.An agar medium for direct enumeration of Staphylococcus aureus:pork plasma medium for S.aureus(PPSA)[J].Canadian Journal of Microbiology,1976,22(11):1603-1611.
[7]Klapes N A.Comparison of Vogel-Johnson and Baird-Parker media for membrane filtration recovery of Staphylococci in swimming pool water[J]. Applied and Environmental Microbiology,1983,46(6):1318-1322.
[8]蔡双福,周芳梅,伍笑平.食品中金黄色葡萄球菌计数方法的比较研究[J].现代食品科技,2010,26(12):1409-1411.
[9]梁景涛,谢翊,林秋芬,等. 3种食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[J].中国卫生检验杂志,2010,20(4):790-791.
[10]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.28—2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S].北京:中国标准出版社,2013.
[11]Merlino J,Watson J,Rose B,et al.Detection and expression of methicillin/oxacillin resistance in multidrug-resistant and non-multidrug-resistant Staphylococcus aureus in Central Sydney,Australia[J].J Antimicrob Chemother,2002,49(5):793-801.
[12]CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twenty-fifth informational supplement[A].PA,2015.
[13]Bannerman T L,Hancock G A,Tenover F C,et al.Pulsed-field gel electrophoresis as a replacement for bacteriophage typing of Staphylococcus aureus[J].Journal of Clinical Microbiology,1995,33(3):551-555.
[14]Aanensen D.Multi locus sequence typing(MLST)[DB/OL].(2016-01-08)[2016-04-01].http://saureus.mlst.net/
[15]张琳,李敏,于莉,等.食品中金黄色葡萄球菌检测方法的比较研究[J].食品工业科技,2006,27(6):166-169.
[16]Hammes W,Schleifer K H,Kandler O.Mode of action of glycine on the biosynthesis of peptidoglycan[J].Journal of Bacteriology,1973,116(2):1029-1053.
[17]WONG C B,Khoo B Y,Sasidharan S,et al.Inhibition of Staphy-lococcus aureus by crude and fractionated extract from lactic acid bacteria[J].Beneficial Microbes,2015,6(1):129-139.