苏昭仑,李丹,张喜金,游景水.反相高效液相色谱法快速测定复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素[J].中国食品卫生杂志,2017,29(1):56-59.DOi:10.13590/j.cjfh.2017.01.012
反相高效液相色谱法快速测定复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素
（汤臣倍健股份有限公司，广东 珠海519040）
作者简介： 苏昭仑男执业药师研究方向为中药和保健食品安全检测E-mail：suwheel@126.com
收稿日期： 2016-07-18
摘要:目的 建立一种快速测定复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素的反相高效液相色谱法。方法样品经0.1 mol/L的碳酸钠溶液破坏微囊，甲醇-乙腈（7∶3，V/V）混合溶液超声提取，采用Agilent SB-C8柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分离，流动相为甲醇-乙腈（9∶1，V/V），检测波长为448 nm。结果β-胡萝卜素在本试验色谱条件下能完全分离，其线性范围为0.41～6.20 μg/ml，平均回收率99.4%～103.3%，RSD＜2.0%。结论该方法操作简便，能测定复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素，精密度和回收率高，重复性好，结果符合要求。
关键词:
β-胡萝卜素； 反相高效液相色谱法； 复方维生素片； 保健食品； 检测方法
文章编号：1004-8456(2017)01-0056-04 中图分类号： R155 文献标识码：A
Rapid determination of β-carotene in compound vitamin tablets
by reverse-phase high performance liquid chromatography
by reverse-phase high performance liquid chromatography
（By-Health Company Limited，Guangdong Zhuhai 519040，China）
Abstract:Objective To establish a method for determination of microencapsulated β-carotene in compound vitamin tablets by reverse-phase high performance liquid chromatography.MethodsMicrocapsules in the samples were destructed with 0.1 mol/L sodium carbonate solution, and ultrasonically extracted with methanol-acetonitrile（7∶ 3，V/V）using Agilent SB-C8 column. Methanol-acetonitrile（9∶ 1，V/V）was the mobile phase, and the detection wavelength was 448 nm. Resultsβ-carotene was completely separated in the chromatographic conditions. The linear range was 0.41-6.20 μg/ml, the average recovery was 99.4%-103.3%, and the RSD was below 2.0%.ConclusionThe method was fast and simple, the precision, recovery, and repeatability met the requirements, and could determine microencapsulated β-carotene in compound vitamin tablets.
Key words:
β-carotene； reverse-phase high performance liquid chromatography； compound vitamin tablets； health food； test method
β-胡萝卜素是一种广泛存在于黄、绿色蔬菜和水果中的天然类胡萝卜素。联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会认定β-胡萝卜素为A类营养食品强化剂。β-胡萝卜素作为维生素A的前体，是保健食品的重要成分，大量研究证实，β-胡萝卜素具有抗氧化［1］、预防维生素缺乏症［2］、抗癌［3-6］、预防心血管疾病、防治白内障和保护肝脏［7-8］等多方面的药理作用。
β-胡萝卜素遇氧、热和光时不稳定，而在弱碱下较稳定，复方维生素片中β-胡萝卜素经过微囊化包埋增加稳定性，但是给检测分析带来了一定的困难。目前，常用来分析β-胡萝卜素的方法有纸层析法［9］、薄层色谱法、分光光度法和高效液相色谱法［10-21］等。前三种分析方法过程复杂、精密度差，而高效液相色谱法灵敏度高、准确，在β-胡萝卜素的测定中得到广泛的应用。但报道文献中高效液相色谱法样品前处理采用回流皂化，操作繁琐，难以实现全程避光，β-胡萝卜素损失较大，采用C18柱分离，仪器分析时间较长，不适合企业大批量检测的需求［10,19-21］。本试验简化样品前处理过程，优化色谱条件，建立了反相高效液相色谱法快速测定复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素，提高了测定结果的准确性，对β-胡萝卜素的质量控制具有一定的研究价值和经济效益。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
维他客多种维生素矿物质片、多种维生素片（女士）、每日每加多种维生素矿物质片（女士），均购自汤臣倍健股份有限公司。
1.1.2主要仪器与试剂
1260型高效液相色谱仪（配DAD，美国安捷伦），分析天平。β-胡萝卜素（批号41030，纯度96.3%，德国Dr．Ehrenstorfer），甲醇、乙腈均为色谱纯，三氯甲烷、无水碳酸钠均为分析纯，纯化水。
1.2方法
1.2.1标准溶液的配制
标准储备液：精密称取β-胡萝卜素对照品10.73 mg，置于烧杯中，加三氯甲烷溶解，再转移至100 ml棕色容量瓶中并定容至刻度（浓度约为0.1 mg/ml），储备液于-18 ℃冰箱中储存备用。标准工作液：分别精密移取储备液0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 ml于50 ml棕色容量瓶中，用甲醇-乙腈（7∶3，V/V）混合溶液定容至刻度，摇匀，β-胡萝卜素浓度分别为0.41、1.03、2.07、4.13、6.20 μg/ml。
1.2.2样品前处理
将样品粉碎，精密称取100.0 mg样品粉末于50 ml棕色容量瓶中，加入2.0 ml 0.1 mol/L的碳酸钠溶液，混匀，室温超声破坏微囊5 min，加入甲醇-乙腈（7∶3，V/V）混合溶液40 ml，室温超声提取15 min，冷却至室温，用甲醇-乙腈（7∶3，V/V）混合溶液定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
1.2.3仪器条件
色谱柱：Agilent SB-C8（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速1.0 ml/min；柱温40 ℃；进样量10 μl；检测波长448 nm；流动相A为甲醇，B为乙腈，A∶B=9∶1。
2结果与分析
2.1方法波长的选择
在1.2.3色谱条件下，对β-胡萝卜素标准工作液进行全波长扫描，在448 nm处有最大吸收峰，故本试验选择448 nm波长测定，见图1。
在1.2.3色谱条件下，对β-胡萝卜素标准工作液进行全波长扫描，在448 nm处有最大吸收峰，故本试验选择448 nm波长测定，见图1。
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图1β-胡萝卜素光谱 Figure 1Spectrum of β-carotene |
2.2方法专属性试验
在1.2.3色谱条件下，β-胡萝卜素的保留时间为5.18 min，分离度良好，无干扰，见图2。进行全波长扫描，阈值设置为999，检查样品中β-胡萝卜素的峰纯度，能得到良好的纯度，证明该方法具有很好的专属性。
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图2空白样品、β-胡萝卜素对照和样品的色谱图 Figure 2Chromatogram of blank samples，β-carotene contrast and samples |
2.3线性关系
在试验条件下，对标准工作液进行测定，结果表明，β-胡萝卜素在0.41～6.20 μg/ml范围内有良好的线性关系，r=1.000 00，线性方程： y=153.70783x+1.09134。
2.4精密度试验
在试验条件下，对同一标准工作液进行重复进样6次测定，结果显示，其保留时间稳定，β-胡萝卜素浓度为2.071 3～2.101 9 μg/ml，RSD为0.6%。结果表明，精密度良好。
在试验条件下，对同一标准工作液进行重复进样6次测定，结果显示，其保留时间稳定，β-胡萝卜素浓度为2.071 3～2.101 9 μg/ml，RSD为0.6%。结果表明，精密度良好。
2.5稳定性试验
精密称取100.0 mg样品，按1.2.2中的方法制得供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、8 h进样，测定β-胡萝卜素浓度为2.904 3～2.970 2 μg/ml，RSD为0.8%。结果表明，供试品溶液8 h内稳定。
2.6重复性试验
分别精密称取100.0 mg样品，按1.2.2中的方法制得供试品溶液，测定β-胡萝卜素的含量。检测结果略高于理论值含量，其RSD分别为1.3%、1.0%、1.4%，表明该方法准确，重复性好，见表1。
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表1β-胡萝卜素的重复性试验（n=6） Table 1Repeatability of β-carotene |
2.7最低检出限和最低定量限试验
取信噪比3∶1时为最低检出限，β-胡萝卜素的浓度为0.022 μg/ml；取信噪比10∶1时为最低定量限，β-胡萝卜素的浓度为0.074 μg/ml。
2.8回收率试验
精密称取已测定含量（104.9 mg/100 g）的同一样品9份，分别添加0.50、1.00、1.50 ml标准储备液（103.3 μg/ml）进行加标回收试验，结果见表2。本方法平均回收率99.4%～103.3%，且RSD＜2.0%，说明该方法准确度可以满足β-胡萝卜素的检测要求。
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表2加标回收率和RSD（n=3） Table 2Recoveries and relative standard deviation |
2.9与国标方法对比
分别精密称取100.0 mg样品，按本方法与GB 5413.35—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定》［10］的样品前处理，制得供试品溶液，测定β-胡萝卜素的含量。本方法检测结果与国标对比，相对偏差为4.6%，表明该方法检测结果准确，见表3
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表3样品前处理方法的对比（n=6） Table 3Comparative sample pre-treatment methods |
3讨论
本试验采用反相高效液相色谱法、等度洗脱，测定了复方维生素片中微囊化β-胡萝卜素的含量，为该类制剂质量标准的制定提供了定量依据。采用甲醇、甲醇-乙腈（9∶1，V/V）、甲醇-乙腈（7∶3，V/V）、甲醇-乙腈（5∶5，V/V）为提取溶剂，提取时间为15 min，结果表明，甲醇提取率最低，甲醇-乙腈（9∶1，V/V）提取率明显升高，甲醇-乙腈（7∶3，V/V）与甲醇-乙腈（5∶5，V/V）的提取率并无明显差别，因此，采用甲醇-乙腈（7∶3，V/V）作为提取溶剂。
本试验中β-胡萝卜素为微囊包埋制剂，破坏微囊的方式的选择至关重要。大部分方法采用皂化，但操作繁琐，难以实现全程避光，β-胡萝卜素损失较大［10,19-21］。本试验采用0.1 mol/L的碳酸钠溶液超声破坏微囊，而且碳酸钠溶液为弱碱性，为β-胡萝卜素提供了稳定的溶液环境，操作简捷，能达到快速检测的要求。
若采用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分离β-胡萝卜素，单次分析时间超过30 min。因此，选用C8柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），在此条件下，β-胡萝卜素不受杂质干扰，整个运行时间缩短至6 min以内，提高了检测的效率，适用于大批量生产的检验。
参考文献
［1］ZHANG P，Omaye S T．Antioxidant and prooxidant roles for β-carotene，α-tocopherol and ascorbic acid in human lung cells［J］．Toxicology in Vitro，2001，15（1）：13-24．
［2］Mathews-Roth M M，Pathak M A，Fitzpatrick T K．β-carotene therapy for erythropoietic protoporphyria and other photosensitivity diseases［J］．Archives of Dermatology，1977，113（9）：1229-1234．
［3］Tamimi R M，Hankinson S N，Campos H，et al．Plasma carote-noids，retinol，and tocopherols and risk of breast cancer［J］． American Journal of Epidemiology，2005，161（2）：153-160．
［4］Kim H J，Kim M K，CHANG W K，et al．Effect of nutrient intake and Helicobacter pylori infection on gastric cancer in Korea: a case-control study［J］．Nutrition and Cancer，2005，52（2）：138-146．
［5］Duli n＇ska J，Gil D，Zagajewski J，et al．Different effect of β-carotene on proliferation of prostate cancer cells［J］．Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease，2005，1740（2）：189-201．
［6］Steinel H H，Baker R S U．Effects of β-carotene on chemically-induced skin tumors in HRASkh hairless mice［J］．Cancer Letters，1990，51（2）：163-168．
［7］Oliver L K．Colorimetric analysis of vitamin A and carotene［J］．Methods in Enzymology，1980，67：199-203．
［8］Jialal I，Fuller C J．Oxidized LDL and antioxidants［J］．Clinical Cardiology，1993，16（1）：16-19．
［9］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会．GB/T 5009.83—2003 食品中胡萝卜素的测定［S］．北京：中国标准出版社，2003．
［10］中华人民共和国卫生部．GB 5413.35—2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定［S］．北京：中国标准出版社，2010．
［11］Prates J A M，Quaresma M A G，Bessa R J B，et al．Simultaneous HPLC quantification of total cholestero1, tocopherols and β-carotene in Barrosa-PDO veal［J］．Food Chemistry，2006，94（3）：469-477．
［12］Kandlakunta B，Rajendran A，Thingnganing L．Carotene content of some common（cereals，pulses，vegetables，spices and condiments）and unconventional sources of plant origin［J］．Food Chemistry，2008，106（1）：85-89．
［13］Barba A I O，Hurtado M C，Mata M C S，et al．Application of a UV-vis detection-HPLC method for a rapid determination of lycopene and β-carotene in vegetables［J］．Food Chemistry，2006，95（2）：328-336．
［14］Hosotani K，Kitagawa M．Improved simultaneous determination method of β-carotene and retinol with saponification in human serum and rat liver［J］．Journal of Chromatography B，2003，791（1/2）：305-313．
［15］潘红艳，郭启雷，杨红梅．高效液相色谱法测定杏果肉中β-胡萝卜素含量［J］．食品研究与开发，2015，36（3）：107-109．
［16］胡建中，王可兴，潘思轶．高效液相色谱法测定柑橘汁中类胡萝卜素［J］．食品科学，2006，27（12）：634-636．
［17］苟锐锋，柴沙驼，高丹，等．牦牛肉及脂肪中β-胡萝卜素含量测定［J］．食品研究与开发，2014，35（22）：82-86．
［18］罗光宏，王勤，袁小龙，等．RP-HPLC法测定螺旋藻中β-胡萝卜素的含量［J］．食品科学，2013，34（22）：243-245．
［19］宋书锋，张烁，刘艳君，等．高效液相色谱法测定保健食品中微囊化β-胡萝卜素［J］．中华预防医学杂志，2011，45（5）：447-448．
［20］刘梅芳，李帮锐，刘永康，等．高效液相色谱法测定保健食品中β-胡萝卜素［J］．中国卫生检验杂志，2013，23（4）：847-848．
［21］韩志辉，许克平．高效液相色谱法测定复方维生素片中β-胡萝卜素［J］．理化检验-化学分册，2013，49（4）：411-416．
［2］Mathews-Roth M M，Pathak M A，Fitzpatrick T K．β-carotene therapy for erythropoietic protoporphyria and other photosensitivity diseases［J］．Archives of Dermatology，1977，113（9）：1229-1234．
［3］Tamimi R M，Hankinson S N，Campos H，et al．Plasma carote-noids，retinol，and tocopherols and risk of breast cancer［J］． American Journal of Epidemiology，2005，161（2）：153-160．
［4］Kim H J，Kim M K，CHANG W K，et al．Effect of nutrient intake and Helicobacter pylori infection on gastric cancer in Korea: a case-control study［J］．Nutrition and Cancer，2005，52（2）：138-146．
［5］Duli n＇ska J，Gil D，Zagajewski J，et al．Different effect of β-carotene on proliferation of prostate cancer cells［J］．Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease，2005，1740（2）：189-201．
［6］Steinel H H，Baker R S U．Effects of β-carotene on chemically-induced skin tumors in HRASkh hairless mice［J］．Cancer Letters，1990，51（2）：163-168．
［7］Oliver L K．Colorimetric analysis of vitamin A and carotene［J］．Methods in Enzymology，1980，67：199-203．
［8］Jialal I，Fuller C J．Oxidized LDL and antioxidants［J］．Clinical Cardiology，1993，16（1）：16-19．
［9］中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会．GB/T 5009.83—2003 食品中胡萝卜素的测定［S］．北京：中国标准出版社，2003．
［10］中华人民共和国卫生部．GB 5413.35—2010 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定［S］．北京：中国标准出版社，2010．
［11］Prates J A M，Quaresma M A G，Bessa R J B，et al．Simultaneous HPLC quantification of total cholestero1, tocopherols and β-carotene in Barrosa-PDO veal［J］．Food Chemistry，2006，94（3）：469-477．
［12］Kandlakunta B，Rajendran A，Thingnganing L．Carotene content of some common（cereals，pulses，vegetables，spices and condiments）and unconventional sources of plant origin［J］．Food Chemistry，2008，106（1）：85-89．
［13］Barba A I O，Hurtado M C，Mata M C S，et al．Application of a UV-vis detection-HPLC method for a rapid determination of lycopene and β-carotene in vegetables［J］．Food Chemistry，2006，95（2）：328-336．
［14］Hosotani K，Kitagawa M．Improved simultaneous determination method of β-carotene and retinol with saponification in human serum and rat liver［J］．Journal of Chromatography B，2003，791（1/2）：305-313．
［15］潘红艳，郭启雷，杨红梅．高效液相色谱法测定杏果肉中β-胡萝卜素含量［J］．食品研究与开发，2015，36（3）：107-109．
［16］胡建中，王可兴，潘思轶．高效液相色谱法测定柑橘汁中类胡萝卜素［J］．食品科学，2006，27（12）：634-636．
［17］苟锐锋，柴沙驼，高丹，等．牦牛肉及脂肪中β-胡萝卜素含量测定［J］．食品研究与开发，2014，35（22）：82-86．
［18］罗光宏，王勤，袁小龙，等．RP-HPLC法测定螺旋藻中β-胡萝卜素的含量［J］．食品科学，2013，34（22）：243-245．
［19］宋书锋，张烁，刘艳君，等．高效液相色谱法测定保健食品中微囊化β-胡萝卜素［J］．中华预防医学杂志，2011，45（5）：447-448．
［20］刘梅芳，李帮锐，刘永康，等．高效液相色谱法测定保健食品中β-胡萝卜素［J］．中国卫生检验杂志，2013，23（4）：847-848．
［21］韩志辉，许克平．高效液相色谱法测定复方维生素片中β-胡萝卜素［J］．理化检验-化学分册，2013，49（4）：411-416．