DOi:10.13590/j.cjfh.2017.04.005
不同来源肠炎沙门菌毒力基因特征分析
牛莉娅1,秦丽云2,徐保红2,王燕1,杨新英1,孙殿兴1,郭玉梅2

(1.白求恩国际和平医院传染肝病科,河北 石家庄050082; 2.石家庄市疾病预防控制中心,河北 石家庄050011)

作者简介: 牛莉娅女主治医师研究方向为感染性疾病的临床诊治E-mail:83040073@qq.com 通信作者: 郭玉梅女主管技师研究方向为病原菌分子分型与耐药E-mail:guokexin2199@163.com

收稿日期: 2017-06-28

基金项目:河北省卫生计生委2017年度医学科学研究重点课题(20170964)

摘要:目的 研究石家庄地区不同来源的肠炎沙门菌毒力基因携带情况的差异及特点。方法 收集石家庄地区早市生禽销售点、生禽屠宰场及食物中毒标本中分离出的肠炎沙门菌124株,对其中8种毒力基因(invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA)进行聚合酶链式反应(PCR)检测。结果 肠炎沙门菌具有不同的毒力基因谱型,8种毒力基因在不同来源的肠炎沙门菌中均有检出,其中毒力基因invA、sopE、stn、hilA、spvR、pefA在食物中毒分离株中的携带率高,均在94%以上。食物中毒分离株与早市生禽销售点分离株的8种毒力基因携带率差异无统计学意义(P>0.05),而生禽屠宰场分离株与食物中毒和早市生禽销售点分离株之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 石家庄地区早市生禽销售点检出的肠炎沙门菌中易致病的高风险株较多,应加强对生禽的卫生监督与防控。
关键词:  食物中毒; 肠炎沙门菌; 毒力基因; 生禽; 屠宰场; 销售点; 食源性致病菌
中图分类号: R155      文献标识码:A      文章编号:1004-8456(2017)04-0412-06
Analysis of the characteristics of Salmonella enteritidis virulence genes from different origins
NIU Li-ya1, QIN Li-yun2, XU Bao-hong2, WANG Yan1, YANG Xin-ying1
     SUN Dian-xing1, GUO Yu-mei2

(1.Department of Infectious and Liver disease, Bethune International Peace Hospital,Hebei Shijiazhuang 050082,China; 2.Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention,Hebei Shijiazhuang 050011,China)

Abstract:Objective To investigate the differences and characteristics of virulence genes carried by Salmonella enteritidis from different sources in Shijiazhuang City. Methods One hundred and twenty-four strains of Salmonella enteritidis isolated from morning markets of raw and poultry stalls, slaughterhouses and food poisoning specimens in Shijiazhuang area were collected. Eight virulence genes (invA, sopE, agfA, spvR, hilA, stn, pefA, shdA) were detected by polymerase chain reaction (PCR). Results Salmonella enteritidis might have different virulence gene profiles. The above eight virulence genes were detected in different strains. The carrying rate of virulence genes invA, sopE, stn, hilA, spvR and pefA in the food poisoning strains was higher than 94%. There was no difference in the carrying rate of 8 virulence gene between the morning raw poultry stalls isolates and the patient strains, but was different with the slaughterhouse strains. Conclusion There were more risks of food poisoning caused by Salmonella enteritidis from morning markets, and the hygiene supervision should be strengthened to prevent and control foodborne disease.
Key words:  Food poisoning; Salmonella enteritidis; virulence genes; raw poultry; slaughterhouse; stall of sale; foodborne pathogens
        沙门菌病是世界范围内最重要的食源性致病菌之一[1-2],目前已确认的2 500多种血清型中,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌是全世界范围内最常见的血清型[3-4]。近年来在我国许多地区,肠炎沙门菌成为引发沙门菌病的最主要血清型[5-8],具有重要的流行病学意义。据报道[9-10],石家庄地区近年来非伤寒沙门菌病例中,肠炎沙门菌也占据首位。
        沙门菌之所以能够致病,是因为有许多毒力基因的存在,这些毒力基因主要分布在沙门菌的染色体和质粒中,包括编码结构性毒力因子(菌毛、鞭毛、脂多糖、荚膜)的基因、肠毒素基因和某些调节基因[11-12]。近年来,随着现代分子生物学技术的不断发展和应用,对沙门菌毒力基因的研究不断深入。通过查阅国内外文献,本研究选定了沙门菌较为热点的8种毒力基因(invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA)进行调查分析。其中,invA为沙门菌的主要毒力因子,该基因决定了沙门菌的侵袭力,与其致病性密切相关[13-14]sopE基因,与宿主细胞的侵入有关[15]hilA是SPI1-III型分泌系统的中心调节子,直接控制inv/spa操纵子的表达,且所有组成部分的产物都是分泌组织起作用所必须的[16-17]stn肠毒素基因是沙门菌感染机制中重要的毒力因子之一,其编码产物能诱发小鼠肠腔液体分泌反应[18]。毒力质粒上的spvSalmonella plasmid virulence)基因与沙门菌在宿主细胞内的存活和快速生长有关,毒力表现为细胞毒性,其表达是依赖于spvR的正向调控[19-20]。质粒上还有一些其他的基因座可能在感染阶段发挥了重要作用,如菌毛操纵子pef,主要由4个相关基因(pefA、pefB、pefC、pefD)编码,作用是通过伴侣诱导的装配途径调节细菌对肠上皮细胞的粘附[21]。菌毛是位于菌体表面的纤细结构,由AgfA、AgfB和AgfC三个亚基组成[22]。菌毛和鞭毛的共同作用,使沙门菌黏附于宿主肠道上皮细胞并在肠粘膜定植,从而感染宿主。ShdA是一个大型的外膜蛋白特异性识别和结合蛋白,参与沙门菌在回肠末端淋巴结和盲肠的定植[23]
据报道[24-26],引起沙门菌食物中毒的食品,超过90%是肉类等动物性产品,特别是家禽及其制品。本研究通过对2013—2016年石家庄地区4起肠炎沙门菌食物中毒事件分离株,5个早市不同生禽销售点、3家大型生禽屠宰场分离株的毒力基因携带情况进行调查和比较分析,为石家庄地区肠炎沙门菌的监测提供科学的试验数据。     
1材料与方法     
1.1材料
1.1.1菌株来源
        收集2013—2016年石家庄地区4起肠炎沙门菌致食物中毒事件中分离留存的肠炎沙门菌17株(分离自不同患者或食物),5个早市中不同流动生禽销售点检出的肠炎沙门菌51株,3家大型生禽屠宰场检出的肠炎沙门菌56株,共计124株。  
1.1.2主要仪器与试剂
        Veriti型PCR扩增仪(美国AB),xcel型全自动毛细管电泳仪(德国Qiagen)。亚硒酸盐胱氨酸增菌液、尿素酶生化管、SS琼脂、HE琼脂均购自北京陆桥技术股份有限公司,沙门显色培养基(法国科马嘉),API 20E(法国梅里埃),沙门菌属诊断血清(宁波天润生物药业有限公司),5×Buffer、Taq酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、聚合酶链式反应(PCR)引物均购自大连宝生物工程有限公司,测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。  
1.2方法  
1.2.1细菌DNA模板的制备
        采用煮沸法提取细菌的DNA模板,刮取纯培养菌落至200 μl无菌纯水中制成菌悬液,100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min,4 ℃ 10 000 r/min离心5 min,取上清液作为DNA模板,-20 ℃保存备用。无菌纯水作为阴性模板对照。   
1.2.2PCR反应体系与反应条件
        沙门菌常见的毒力基因引物序列见表1。PCR反应体系(25 μl):5×Buffer 5.0 μl、dNTP 2.0 μl、Taq酶(5 U/μl)0.25 μl、上下游引物各0.5 μl、DNA模板0.5 μl、无菌纯水16.25 μl。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共进行30个循环;72 ℃终延伸7 min;4 ℃保存。    
1.2.3PCR产物分析
将毛细管电泳出现阳性条带的PCR产物纯化后,部分送上海生工双向测序,结果在GenBank进行在线比对,以验证PCR产物的正确性。   
1.3统计学分析
应用SPSS软件,对检出率的比较用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义。    
2结果     
2.1肠炎沙门菌8种毒力基因检出结果
        对124株肠炎沙门菌8种毒力基因(invA、sopE、agfA、spvR、hilA、stn、pefA、shdA)的PCR检测结果见表2。毒力基因invA、sopE、hilA、stn的携带率较高,分别为92.7%(115/124)、91.9%(114/124)、89.5%(111/124)、83.1%(103/124),毒力基因spvR、pefA的携带率均为53.2%(66/124),毒力基因shdA、agfA携带率较低,分别为29.0%(36/124)和23.4%(29/124)。   
2.2不同来源的肠炎沙门菌毒力基因携带情况分析
        124株肠炎沙门菌中,每种毒力基因携带率在不同来源菌株中不同,其中食物中毒分离株与早市生禽销售点分离株中各种毒力基因的携带情况相似,差异无统计学意义(P>0.05),见图1。上述两类菌株中毒力基因invA、sopE、spvR、hilA、stn、pefA的携带率均高于毒力基因agfA、shdA,差异有统计学意义(P<0.05)。而生禽屠宰场分离株与食物中毒分离株和早市生禽销售点分离株的部分毒力基因的携带情况不同,其中毒力基因spvR、pefA的携带率明显低于后两类菌株,而毒力基因shdA的携带率明显高于后两类菌株。
 表1PCR引物序列
Table 1Primer sequences used in this study   
表2肠炎沙门菌毒力基因检出情况
Table 2Detection of eight virulence genes in Salmonella enteritidis species    
图1不同来源肠炎沙门菌毒力基因携带率比较     
Figure 1Comparison of the prevalence rate of virulence genes 
of Salmonella enteritidis isolates from different originates        
2.3肠炎沙门菌食物中毒分离株毒力基因谱型
食物中毒肠炎沙门菌分离株毒力基因谱型分为5个,其中优势谱型为invA+sopE+spvR+hilA+stn+pefA,占70.6%(12/17),见图2。
图2肠炎沙门菌食物中毒分离株毒力基因谱型分布     
Figure 2Distribution of virulence genes of Salmonella 
     enteritidis isolates from food poisoning        
2.4早市生禽销售点分离的肠炎沙门菌毒力基因谱型
早市生禽销售点检出的肠炎沙门菌分离株毒力基因谱型分为11个,其中优势谱型也是invA+sopE+spvR+hilA+stn+pefA,占41.2%(21/51),见图3。
图3肠炎沙门菌早市生禽销售点分离株毒力 基因谱型分布    
Figure 3Distribution of virulence genes of Salmonella      
enteritidis isolates from different morning markets 
     of raw and poultry stalls
2.5生禽屠宰场分离的肠炎沙门菌毒力基因谱型
石家庄地区生禽屠宰场检出的肠炎沙门菌分离株毒力基因谱型更为分散,分为16个,其中优势谱型是invA+sopE+hilA+stn+shdA,占41.1%(23/56),见图4。
图4肠炎沙门菌生禽屠宰场分离株毒力基因谱型分布
Figure 4Distribution of virulence genes of Salmonella 
     enteritidis isolates from different slaughterhouses         
2.6三者优势毒力基因谱型的比较
本研究所有肠炎沙门菌中,食物中毒分离株和早市生禽销售点分离株的优势毒力基因谱型一致,较生禽屠宰场分离株的优势毒力基因谱型多两种毒力基因spvRpefA,少一种毒力基因shdA。    
 3讨论
        肠炎沙门菌是非伤寒沙门菌血清型之一,是最早发现能够引起大规模食物中毒的沙门菌血清型,也是近年来我国沙门菌食物中毒暴发和流行案例的主要病原[30-33]。据国内外报道[34-38],沙门菌的毒力基因谱型与血清型的关系并不一致。本研究也显示,同为肠炎沙门菌血清型,可以表现出不同的毒力基因谱型,且其毒力基因谱型也会受到菌株来源的影响。
        本研究发现石家庄地区肠炎沙门菌中毒力岛(SPI1)上的基因(invA、sopE、hilA)和编码肠毒素的基因(stn)携带率均在80%以上,具有较高的遗传稳定性,与国内外报道[35,38-39]较为一致。而编码菌毛和外膜蛋白的基因(agfA、shdA)携带率低,均在30%以下,与国外报道[23,40]一致,菌毛和外膜蛋白在该血清型菌株致病过程中的作用有待进一步探讨。
        虽然菌株的致病性受诸多毒力基因元件相互调控及受染宿主本身免疫状态等多因素的影响,但毒力基因的存在是菌株致病的前提,毒力基因携带情况的不同,影响着菌株致病性的强弱。本研究结果中,食物中毒分离株毒力基因invA、sopE、stn、hilA、spvR、pefA的携带率较高,均在94%以上,同时携带这6种毒力基因的谱型为食物中毒分离株的优势谱型。根据国内外研究报道[13-21],这6种毒力基因分布在SPI1、毒力质粒及编码肠毒素的基因上,均与菌株的致病性关系密切,因此,可以认为同时携带这6种毒力基因的菌株是更易引起食物中毒的高风险株。这些高风险株的存在,对人群健康存在着潜在的严重威胁[41-42]
        本研究中,2013—2016年石家庄地区5个早市不同生禽销售点检出的肠炎沙门菌与食物中毒分离株的毒力基因携带情况差异无统计学意义(P>0.05),绝大部分为高风险株,有导致食源性疾病暴发的潜在风险,应引起食品监管部门的重视。而生禽屠宰场检出的沙门菌菌株毒力基因谱型更加多样性,根据毒力基因谱型比较,生禽屠宰场分离株中高风险株少(3.6%),与食物中毒分离株比较差异明显,并且绝大多数菌株缺少毒力质粒相关基因spvR和pefA。沙门菌在肠道定居、侵入上皮组织以及刺激肠液外渗等都与其所携带的毒力质粒密切相关[19]。生禽屠宰场分离株毒力质粒的携带率低,降低了该来源菌株的致病性。根据以上数据,早市生禽销售点分离株中的高风险株较生禽屠宰场分离株多,提示肠炎沙门菌高风险株的污染更可能出现在生禽食品的终端销售环节。故鉴于此次研究结果,食品卫生监管中应该加强对各早市生禽销售点储存和销售环节的卫生监督,做好生熟食的分类与存放工作,防止食源性疾病的暴发。
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