母乳可提供婴儿正常生长发育所需的全部营养成分和多种生物活性物质，是婴儿的最佳食物^［1］。游离母乳低聚糖（human milk oligosaccharides, HMOS）是母乳中仅次于乳糖和脂类的第三大固体组分^［2］，通常由3～14个单糖组成，在核心结构的基础上可分为中性HMOS（末端为L-岩藻糖）和酸性HMOS（末端为唾液酸）^［3］。HMOS不能被婴幼儿小肠的内源性酶消化，其具有多种重要功能，包括减少感染^［4］、维持肠道微生态平衡^［5］、发挥免疫调节因子的作用^［6］及参与脑组织中神经节苷脂和糖蛋白构成^［7］等。有研究^［8］报道了3个月内不同泌乳时期对HMOS的影响，泌乳时期的增加伴随着婴儿生长发育状况的变化，HMOS的变化可能与婴儿的发育状况变化相关。但目前还缺乏更长泌乳时期的研究及中国人群的相关研究。本研究中，应用超高效液相色谱-荧光检测（UHPLC-FLD）法对中国人群母乳中10种HMOS进行检测^［9］，比较从初乳至产后6个月间不同阶段母乳中HMOS含量的变化，从而有助于阐明不同结构HMOS的功能，以及母乳在婴儿生长发育不同阶段的作用变化。
     分别于江苏南京及黑龙江齐齐哈尔，采用便携式自动吸奶器，于上午8∶00～11∶00间，分别在产后0～7 d（初乳）、8～15 d（过渡乳）、16～180 d（成熟乳）取每位母亲单侧乳房乳汁不少于5 ml，采集后立即分装密封，存放于冷链包或-20 ℃冰箱，并在冷藏状态下尽快转移至-80 ℃冰箱，避光保存，共取得102份样品。   
      U3000超高效液相色谱仪（配备荧光检测器，美国Dionex）、冷冻离心机、分析天平、超声水浴、恒温水浴锅、恒温烘箱。
10种HMOS对照品的基本信息详见表1，均购自法国Elicityl Oligo Tech；内标为昆布三糖（laminaritriose，CAS：3256-04-0，美国Sigma）。乙腈（色谱纯），甲酸、氢氧化铵、二甲基亚砜（DMSO）、乙酸、2-氨基苯甲酰胺（2-AB，CAS：88-68-6）、氰基硼氢化钠（CAS：25895-60-7）均为分析纯，试验用水为超纯水。
        对照品溶液：分别精密称取2′FL、3′FL对照品各10.00 mg于1 ml超纯水中，LNT、LNFP-I对照品各15.00 mg于1 ml超纯水中，3′SL、6′SL、PI、LNnT、LNFP-V、LNnFP-V各10.00 mg于10 ml超纯水中，浓度范围为843～17 874 nmol/ml，备用。将2′FL、3′FL、LNT、LNFP-I对照品溶液依次稀释2、5、6.65、10、20、50、125倍，将3′SL、6′SL、PI、LNnT、LNFP-V、LNnFP-V对照品溶液依次稀释1.33、2、4、10、25倍。
内标溶液：准确称取15.00 mg昆布三糖至10 ml容量瓶中，以超纯水为溶剂制备内标溶液。   
        将母乳置于50 ℃烘箱20～30 min，放置到室温涡旋均匀后吸取40 μl至2 ml离心管中并记录重量。每份样品进行2次平行试验。以已测得HMOS含量的母乳样品为质控样品，每次试验以与待测样品相同的步骤进行处理。    
        在放置样品/对照品的2 ml离心管中加入内标溶液20 μl，涡旋均匀后吸取20 μl至另一2 ml离心管中，加入200 μl 2-AB荧光标记溶液（0.35 mol/L 2-AB+1.0 mol/L氰基硼氢化钠，溶剂为含有30%乙酸的DMSO），混匀后置于（65±1）℃水浴中2 h，再将离心管放入4 ℃冰箱中至完全冷却。在离心管中加入1 ml 25%乙腈，10 000×g，4 ℃离心5 min取上清液至色谱中检测。    
        俘获柱为ACQUITYBEH Amide预柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm），分离柱为ACQUITY UPLC BEH Amide（3.0 mm×150 mm，1.7 μm）。流动相：梯度洗脱A相为100%乙腈；B相为50 mmol/L甲酸铵（pH=4.4，甲酸、氢氧化铵及水配制而成）。俘获柱洗脱程序：5%B等度（0～2.5 min），5%～90%B线性变换（2.5～4 min），90%B等度（4～62 min），90%～5%B线性变换（62～65 min）。分离柱洗脱程序：10%B等度（0～6 min），10%～18%B线性变换（6～40 min），18%～19.5%B线性变换（40～60 min），19.5%～70%B线性变换（60～61 min），70%B等度（61～65 min）。检测波长：激发波长330 nm，发射波长420 nm。柱温60 ℃，流速0.8 ml/min，进样量3 μl。 
        以对照品溶液浓度与内标溶液浓度的比值（对照品溶液浓度/内标溶液浓度）为横坐标（x），以对照品色谱峰面积与内标色谱峰面积的比值（对照品色谱峰面积/内标色谱峰面积）为纵坐标（y），绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数R²。根据保留时间对样品中的HMOS进行定性，根据标准曲线进行定量，两次重复取平均值，结果以μg/g表示。
        采用SPSS 18.0，不同泌乳阶段数据采用均值±标准差（±s）描述，采用散点图和Person相关分析对泌乳时间与HMOS含量的相关性进行分析，组间比较采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。   图1为10种HMOS对照品混合标准色谱图，图2为样品色谱图。在选定的色谱条件下，10种HMOS可完全分离，峰形良好。样品经处理后，基质几乎不影响HMOS的检出。
表2可知，在一定浓度范围内，10种HMOS均具有良好的线性关系。
共采集母乳102份，泌乳时间为3～175 d，其中初乳37份占36.3%，平均泌乳时间为（4.92±1.50） d；过渡乳19份占18.6%，平均泌乳时间为（9.21±1.58） d；成熟乳46份占45.1%，平均泌乳时间为（72.67±48.16） d。乳母的年龄为19～   
41岁，平均年龄为（27.62±4.02）岁，其中初乳阶段乳母平均年龄为（26.97±4.60）岁，过渡乳为（28.32±4.69）岁，成熟乳为（27.85±3.16）岁。
经检测，10种HMOS中，2′FL是第一大组分，平均含量为（2 900.36±1 385.13）μg/g，有19.6%（20/102）的母乳中2′FL未检出，未检出LNFP-I的母乳与未检出2′FL的母乳基本一致。仅有5份母乳测出PI，因此不宜继续比较不同泌乳阶段的差异。表3对10种HMOS的平均值及检出率进行了描述。
        Person相关分析显示，泌乳时间与HMOS间存在相关关系。如表4及图3所示，泌乳时间与2′FL间存在负相关关系，即随着泌乳时间的延长，母乳中2′FL的含量呈现下降的趋势。此外，3′SL、6′SL、LNT、LNnT、LNFP-I与泌乳时间也存在负相关关系，而3′FL与泌乳时间存在正相关关系，LNFP-V、LNnFP-V与泌乳时间差异无统计学意义（P>0.05）。
        如图4及表5所示，初乳、过渡乳、成熟乳3个阶段母乳中2′FL、3′SL、LNnT的含量随着分泌时间的延长逐渐降低；6′SL、LNT、LNFP-I的含量在初乳和过渡乳两阶段无明显变化，在成熟乳阶段降低；成熟乳阶段3′FL的含量较初乳和过渡乳阶段明显增加，LNFP-V、LNnFP-V在各泌乳阶段均无明显变化。             HMOS是一大类复杂的混合物，目前已发现超过200种结构。HMOS的合成依靠糖基转移酶，糖基转移酶具有基因多态性，特别是岩藻糖基转移酶-2（FUT2）对母乳中含量较高的2′FL和LNFP-I的合成具有决定性影响^［8］。
FUT2由Secretor基因编码，Secretor基因显性表达时，岩藻糖可通过α1-2键与核心结构连接，可合成2′FL、LNFP-I及PI，隐性表达时则不能合成。同时仅有血型A的乳母可检出PI，因检出数量很少，故本研究不对泌乳时间与HMOS含量的关系进行分析。约20%的母乳中均未检出2′FL和LNFP-I，提示这部分人群Secretor基因隐性表达。在比较不同泌乳时期的这2种HMOS变化时，本研究仅对显性表达的母乳中的含量进行了比较。     
        对HMOS进行检测，通常首先需要去除母乳中的脂肪和蛋白质，如离心沉淀法^［10］、超滤法^［11］、液-液萃取法^［2］和乙腈提取法^［12］等。提取HMOS使用液相色谱-质谱联用的方法进行定量检测^［11］，前处理步骤繁杂，检测仪器要求较高。本研究采用超高效液相色谱-荧光检测法^［9］对10种HMOS进行检测，该方法重复样品测量的相对标准偏差（RSD）为1.8%～8.1%，回收率为98.7%～105%，具有较高的准确性和精密度。在本研究中，10种HMOS的重复样品测量RSD亦达到1.8%～4.9%。该方法前处理步骤简单，不需要去除脂肪和蛋白质，通过引入标记物可实现荧光检测，对检测仪器的要求较低，能实现10种HMOS的完全分离和定量，并通过内标对保留时间迁移进行控制及对待测HMOS的含量进行校正，确保HMOS的定性和定量的准确。
        本研究表明，母乳中HMOS的含量与泌乳时间有关。成熟乳中2′FL、3′SL、6′SL、LNT、LNnT、LNFP-I的含量均较初乳和过渡乳减少，而3′FL则相反，在成熟乳中的含量高于初乳与过渡乳，这一发现与THURL等^［8］的发现一致。不同HMOS随泌乳阶段出现不同变化，可能与婴儿不同生长发育阶段的需求变化有关，如肠道微生态的变化、免疫系统的发展完善等，因此研究HMOS的变化对阐明母乳对婴儿的影响有着重要意义。