氯霉素（chloramphenicol，CAP）属抑菌性广谱抗生素，用于动物各种传染病的治疗。它在动物性食品中的残留会对人体造血系统产生严重不良反应，威胁人类的健康^［1-2］。美国仅允许氯霉素用于非食用动物，规定在动物性食品中不得检出氯霉素，我国早在2002年将氯霉素列为禁用药物，在动物性食品中不得检出。甲硝唑（metronidazolel，MNZ）属于硝基咪唑类合成抗菌药，常添加于动物饲料中，用于治疗和预防动物体内的某些细菌和原虫疾病。硝基咪唑类药物在动物性食品中的残留存在潜在的致癌作用^［3-4］。有些蜂农在蜜蜂临近产蜜期，仍然使用抗生素，是导致蜂蜜中含有抗生素或者超标的原因之一，NY/T 5030—2016《无公害农产品 兽药使用准则》^［5］中规定，甲硝唑片禁止在采蜜期使用。2016年随州市生产的某一品牌蜂蜜成品有3批次检出甲硝唑及氯霉素，引起了社会的广泛关注，产品不合格的主要原因是蜂蜜源头存在安全隐患，因此，必须加强监督控制抗生素的滥用，保障蜂蜜成品的质量。
目前，测定抗生素残留量的方法主要有高效液相色谱法^［6-7］、气相色谱法^［8-9］、气相色谱-质谱法^［10-11］及液相色谱-串联质谱法^［12-13］。高效液相色谱-串联质谱法具有准确、高效、高灵敏度等优点，是目前测定抗生素残留量最为通用的检测手段。本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法对蜂蜜中氯霉素及甲硝唑残留量进行测定，使用各目标分析物的同位素内标进行定量，该方法的灵敏度、回收率和重现性较好，定量准确，可满足日常检测的需要。
    Agilent 6460A超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪（美国Agilent）、千分之一电子天平（精度为0.001 g）、超纯水器、离心机、涡旋混合器、氮吹仪、MCS复合型固相萃取柱（500 mg/6 ml）。
氯霉素（CAS：56-75-7）、甲硝唑（CAS：443-48-1）、D₄-甲硝唑（CAS：1261392-47-5）标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH，D₅-氯霉素标准品（CAS：202480-68-0，美国Cambridge Isotope Laboratories），乙酸乙酯、甲醇均为色谱纯，盐酸、氨水、氢氧化钠均为分析纯。  
    氯霉素、甲硝唑标准储备液：分别称取0.010 g（精确到0.000 01 g）氯霉素、甲硝唑标准品，分别用甲醇溶解并定容至10 ml，浓度均为1.0 mg/ml，-20 ℃避光保存。混合标准溶液：分别准确吸取氯霉素、甲硝唑标准储备液100 μl于100 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，浓度为1.0 μg/ml，-20 ℃避光保存。D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑标准溶液：分别称取0.005 g（精确到0.000 01 g）D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑标准品，分别用甲醇溶解并定容至10 ml，浓度为0.5 mg/ml，-20 ℃避光保存。D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑应用液：分别用甲醇稀释D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑标准溶液至浓度均为20.0 ng/ml，4 ℃保存。    
    称取蜂蜜5 g（精确到0.01 g）于50 ml离心管中，分别加入100 μl D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑应用液，加水10 ml，混匀溶解，再加入10 ml乙酸乙酯，涡旋、超声提取5 min，3 000 r/min离心3 min，吸取上清液在50 ℃氮气下吹干。加入0.1 ml甲醇溶解，再加入1.9 ml 40 mmol/L盐酸溶液，超声溶解1 min，10 000 r/min离心2 min，上清液待净化。依次用5 ml甲醇、5 ml水、5 ml 40 mmol/L盐酸溶液活化平衡MCS复合型固相萃取柱，将上清液移至MCS柱内，待样品过柱后用5 ml水淋洗除杂真空抽干，加入5 ml乙酸乙酯洗脱，得到洗脱液1；再用5 ml甲醇淋洗除杂真空抽干，用5 ml 5%氨化甲醇洗脱，得到洗脱液2；将洗脱液1和2在50 ℃氮气下吹干，分别先加入0.1 ml甲醇超声溶解残留物，再加入0.9 ml 10%甲醇水溶液混匀，过0.22 μm滤膜后进样，洗脱液1用于分析氯霉素，洗脱液2用于分析甲硝唑。     
    色谱：ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸），流速为0.2 ml/min，进样体积为2 μl，洗脱方式为梯度洗脱。洗脱程序：0～0.5 min，40%甲醇；0.5～1.0 min，90%甲醇；0.5～1.5 min，90%甲醇；1.5～2.0 min，40%甲醇。
质谱：电喷雾离子源；氯霉素、D₅-氯霉素为负离子扫描，甲硝唑、D₄-甲硝唑为正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；干燥气流量为11 L/min；雾化器压力为241 kPa；毛细管电压为4 000 V(正离子)、3 500 V(负离子)。
    氯霉素、甲硝唑均易溶于乙酸乙酯，试验表明乙酸乙酯对氯霉素、甲硝唑均有较高的提取效率，因此选用乙酸乙酯提取样品。本试验选择MCS复合型固相小柱，填料为硅胶和阳离子交换树脂，对蜂蜜中氯霉素和甲硝唑的测定起到良好的净化效果。
MCS复合型固相萃取柱对氯霉素、甲硝唑的回收率均在70%以上，且除杂效果好。用乙酸乙酯从MCS柱洗脱获得组分氯霉素，5%氨化甲醇从MCS柱洗脱获得组分甲硝唑。通过MCS柱对蜂蜜中氯霉素及甲硝唑进行分级净化，采用乙酸乙酯和5%氨化甲醇分别洗脱氯霉素和甲硝唑进行分析，可有效除去干扰物质，满足试验要求。    
    比较甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液两种体系，试验发现氯霉素和甲硝唑在甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液体系中响应较高。试验表明，在5 mmol/L乙酸铵溶液中加入少
量的甲酸可以提高甲硝唑的离子化效率，增加灵敏度。为了不影响氯霉素在负电离模式下的离子化效率，本试验还对甲酸的浓度进行了优化，结果表明甲酸浓度为0.05%时对氯霉素的电离没有明显
影响，故本试验采用甲醇-5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）为流动相。由于等度洗脱时待测物与干扰杂质一起流出，对氯霉素及甲硝唑的离子化产生抑制作用和色谱峰背景干扰，因此，本试验采用梯度洗脱的方法，使目标物和杂质达到完全分离。
在电喷雾质谱正/负离子监测模式下，分别对分解电压、碰撞能量和选择离子等进行了充分的优化，选取经碰撞后所得丰度较高的两个离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量及分解电压。4种化合物的质谱分析参数见表1。
用空白蜂蜜基质溶液配制系列混合标准溶液，氯霉素和甲硝唑的浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和5.00 ng/ml，其中D₅-氯霉素、D₄-甲硝唑的浓度均为2.0 ng/ml。以峰面积对应的浓度进行线性回归，其线性关系良好，相关系数r＞0.999。根据信噪比S/N=3和S/N=10计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)，结果见表2。
选择一份空白蜂蜜样品进行加标回收率和精密度试验，样品分别添加0.2、2.0和5.0 μg/kg的混合标准液各6份，摇匀、静置20 min后按1.2.2方法处理并进行分析，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。可以看出，各添加水平的回收率范围为79.3%～96.7%，RSD为5.5%～14.8%，方法的准确度与精密度均满足抗生素分析的要求。加标样品(2.0 μg/kg)的MRM色谱图见图1。
按本试验所建立的方法对呼和浩特市超市采购的20份蜂蜜样品进行测定，甲硝唑及氯霉素均未检出。   
本试验采用乙酸乙酯提取，MCS复合型固相小柱净化，内标法定量，超高效液相色谱-串联质谱法同时测定了蜂蜜中甲硝唑及氯霉素的残留量。该方法与单独测定氯霉素或甲硝唑的方法比较，不仅节省了样品前处理时间、提高了工作效率，而且灵敏度较好，回收率和重现性符合检测要求，可应用于日常大批量样品的检测。