DOi:10.13590/j.cjfh.2017.04.013
超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法快速筛查与确证蔬菜水果中的多种农药残留
蒋万枫,杨钊,张宁,张凤艳

(青岛市食品药品检验研究院,山东 青岛266071)

作者简介: 蒋万枫男高级工程师研究方向为食品检验 E-mail:jwfvip@126.com

收稿日期: 2017-04-25

摘要: 目的应用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术,针对GB 2763—2014《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定的农药残留,整合多种检测方法,建立无需标准品的快速筛查与确证蔬菜、水果中多种农药残留的方法。方法通过一级精确质量数据库比对样品准分子离子的精确质量数、同位素分布与丰度,对蔬菜、水果中农药残留进行初筛,通过实际测定样品的二级谱图与二级谱库中谱图进行比对或通过图谱解析方法进行确证。结果通过基质加标进行了方法验证,10.0和50.0 μg/kg添加水平检出率均为100%,90%以上的农药化合物回收率在70%~120%,并且相对标准偏差(RSD)≤20%(n=5)。对30份蔬菜、水果样品进行筛查与确证,共检出27种农药残留,并依据GB 2763—2014进行了判定,共有2份样品超标。结论该方法的灵敏度、准确性和重复性良好,可以在较短的时间内,甚至在没有标准品的情况下,对GB 2763—2014中数百种农药进行筛查与确证,可为食品安全监管提供有效保障。
关键词:  农药残留; 水果; 蔬菜; 筛查; 确证; 超高效液相色谱; 飞行时间质谱; 食品污染物
中图分类号: R155      文献标识码:A      文章编号:1004-8456(2017)04-0454-06
Rapid screening and confirmation of multiple pesticide residues in vegetable and fruit by ultra
     performance liquid chromatography-Q-time of flight mass spectrometry
JIANG Wan-feng, YANG Zhao, ZHANG Ning, ZHANG Feng-yan

(Qingdao Institute for Food and Drug Control,Shandong Qingdao 266071,China)

Abstract:ObjectiveAn analytical method for rapid screening and confirmation of multiple pesticide residues in vegetable and fruit was established according to GB 2763-2014 national food safety standard-maximum residue limits for pesticides in food, using ultra performance liquid chromatography-Q-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS). MethodsPesticide residues in vegetable and fruit were screened by comparing the accurate mass, isotope distribution and abundance in the accurate mass database, and confirmed by comparing with the spectra in the spectra library or by the spectral analysis method. ResultsThe method was verified by spiked samples, and all pesticides were detected at the addition level of 10.0 and 50.0 μg/kg. The recovery of 90% of the pesticides was in the range of 70%-120%, with relative standard deviation (RSD) ≤20% (n=5). The method was applied to screen pesticides in 30 samples of vegetables and fruits. Twenty-seven pesticides were found and 2 samples exceeded the limit. ConclusionThe method was sensitive, accurate and reproducible. Hundreds of pesticides in GB 2763-2014 could be screened and confirmed in a short period of time even without standard substance. It could provide an effective method for food safety control.
Key words: Pesticide residues; fruit; vegetable; screening; confirmation; ultra performance liquid chromatography; time of flight mass spectrometry; food contaminants
    农药残留问题一直受到全球关注,各国在严格限制高毒农药使用的同时,加强了农药残留限量标准的制定。2014年8月1日开始实施的GB 2763—2014《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[1],规定了387种农药在284种食品中的3 650项限量指标,较此前标准分别增加了65种农药、43种食品及1 357项限量指标,并称为“史上最严农药残留国家标准”。新标准为确保百姓“舌尖上的安全”提供了法定技术依据。
    标准已有,关键在于如何实施。该标准共引用了162个检测方法,涵盖了液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱法、液相色谱法及分光光度法等。但由于有的农药没有给出检测方法,实施全面农药残留检测非常困难,因此,建立农产品中农药多残留的快速筛查方法十分必要。另外,由于食物样品基质的复杂性,在多组分残留分析中,低分辨质谱常出现假阳性,造成结果误判[2]。以四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF-MS)为代表的高分辨质谱技术凭借其在质量精度、全质量数据采集、数据可溯源性和数据库检索等方面的优势,越来越多地应用于多农药残留检测领域[3-4]。本试验应用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱技术(UPLC-Q-TOF-MS),针对GB 2763—2014规定的农药残留,整合多种检测方法,建立了无需标准品,快速筛查与确证蔬菜水果中多种农药残留的方法。
1材料与方法     
1.1材料
1.1.1主要仪器与试剂
    Agilent 1290超高效液相色谱仪、G6530A Q-TOF四极杆飞行时间质谱仪(配有双喷射离子源)均购自美国Agilent,N-EVAP 112氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates),匀浆机,旋涡振荡器,冷冻离心机,Milli-Q超纯水机,电子天平,Syncore PolyVap平行蒸发仪(瑞士Buchi)。
农药标准品(纯度≥95%,德国Dr. Ehrenstorfer GmbH),乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯,乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)和氨基(NH2)吸附剂均购自天津Bonna-Agela。   
1.2方法  
1.2.1样品前处理
    称取10 g经匀浆机均质样品(精确至0.01 g)于50 ml具塞离心管中,依次加入20.0 ml 1%乙酸-乙腈、4.0 g无水MgSO4、1.0 g无水醋酸钠,以3 000 r/min旋涡振荡3 min后,再以8 000 r/min离心5 min,取上层溶液10 ml于预先加有400 mg PSA及1 200 mg MgSO4的离心管中,以3 000 r/min旋涡振荡1 min,再以8 000 r/min离心5 min,取上层溶液5 ml蒸发至近干,加入1.0 ml 0.1%甲酸-甲醇(1∶2,V/V)溶液溶解,并经0.22 μm微孔膜过滤,供上机分析。  
1.2.2仪器条件
    色谱:色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm,1.8 μm);柱温30 ℃;流速0.4 ml/min;进样体积5 μl;流动相:A:0.1%甲酸水,5 mmol/L乙酸铵(ESI+)/5 mmol/L乙酸铵(ESI-),B:甲醇。洗脱条件:0~1 min,95%A;1~8 min,95%~50%A;8~14 min,50%~5%A;14~18 min,5%~2%A;18~19.5 min,2%~95%A;保持95%A 0.5 min,等待下一次进样。
质谱:离子源:双喷射离子源(ESI);雾化气2.76 kPa;干燥气温度325 ℃;干燥气流速7 L/min;鞘气温度350 ℃;鞘气流速11 L/min;毛细管电压3 500 V;喷嘴电压:0 V(ESI+),1 000 V(ESI-);碰撞解离电压135 V;扫描范围:100~1 000 m/z,二级质谱扫描范围和碰撞电压分别根据待测目标化合物设定;采集速率:一级1.5 spectra/s,二级5 spectra/s。
1.2.3数据分析
        数据分析软件为Mass Hunter Qualitative Analysis B06.0.633.0,分子结构解析软件为Mass Hunter MSC B05.00,数据库建立通过Agilent Mass Hunter PCDL Manager(B.04.00)软件完成。一级精确质量数数据库(Database)的建立:对GB 2763—2014中每一种农药进行研究,确定其是否适合超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法检测,主要是通过以下3种方法确定:一是查看GB 2763—2014所引用的检测方法是不是液相色谱-质谱方法,如果引用的是GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[5]、GB/T 20770—2008《粮谷中486种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[6]、GB/T 22968—2008《牛奶和奶粉中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[7]、GB/T 23205—2008《茶叶中448种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[8]、GB/T 23206—2008《果蔬汁、果酒中512种农药及相关化学品残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》[9]、NY/T 1379—2007《蔬菜中334种农药多残留的测定 气相色谱质谱法和液相色谱质谱法》[10]、NY/T 1434—2007《蔬菜中2,4-D等13种除草剂多残留的测定 液相色谱质谱法》[11]、NY/T 1453—2007《蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定 液相色谱-质谱-质谱联用法》[12]、NY/T 1616—2008《土壤中9种磺酰脲类除草剂残留量的测定 液相色谱-质谱法》[13]、NY/T 1679—2009《植物性食品中氨基甲酸酯类农药残留的测定 液相色谱-串联质谱法》[14]、SN/T 0134—2010《进出口食品中杀线威等12种氨基甲酸酯类农药残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[15]、SN/T 2150—2008《进出口食品中涕灭砜威、唑菌胺酯、腈嘧菌脂等65种农药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》[16]、SN/T 2325—2009《进出口食品中四唑嘧磺隆、甲基苯苏呋安、醚磺隆等45种农药残留量的检测方法 高效液相色谱-质谱/质谱法》[17]、SN/T 2560—2010《进出口食品中氨基甲酸酯类农药残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》[18]等表明其适合超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法检测;二是查看《世界常用农药色谱-质谱图集-液相色谱-四极杆-飞行时间质谱图集(第二卷)》[19],如果在该手册中能查到,则说明该农药适合超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法检测;三是在中国知网(http://www.cnki.net/)进行文献检索,如有文献使用液相色谱-质谱方法检测该种农药,则说明其适合超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法检测。运用PCDL软件依次将确定的农药名称、分子式、结构式等内容编辑到数据库中,建立275种农药残留一级精确质量数数据库。
    二级碎片离子特征谱图谱库(Library)的建立:将实验室已有的标准品配制成2 mg/L的混合标准溶液,进行一级采集,通过一级数据库进行检索,确定母离子和保留时间,且重复测定,在Targeted MS/MS采集界面输入农药的母离子、保留时间和相应的碰撞能量。碰撞能量可参考《世界常用农药色谱-质谱图集-液相色谱-四极杆-飞行时间质谱图集(第二卷)》[19]。如果找不到可参考的碰撞能量,需要进行优化碰撞能量,得到母离子不消失、子离子丰富的二级谱图,再将其导入PCDL软件中,建立二级离子碎片特征谱图谱库。
2结果与分析
2.1液相条件的优化
    多种农药残留的筛查,需要一个相对平缓的液相洗脱梯度,使化合物在色谱柱中有所保留,从而与基质中的极性化合物分开,减小基质对分析物的干扰。本试验采用大梯度的洗脱方式,即起始为95%水相,并在18 min内缓慢变化到2%水相,尽可能使各种化合物具有较好的分离度。试验中比较了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)-甲醇和0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)-乙腈4种流动相体系对分离效果的影响。经过多次试验,选择了甲醇-水作为流动相,并在正离子模式水相中添加0.1%甲酸和5 mmol/L乙酸铵,在负离子模式水相中只添加5 mmol/L乙酸锌。添加5 mmol/L乙酸铵可以抑制农药在离子源中生成[M+Na]+峰,[M+H]+信号明显增强,从而提高了检测的灵敏度和稳定性,也有利于使用MSC软件进行结构解析。一级总离子流图见图1。
图1样品一级总离子流图
Figure 1Total ion current of sample       
2.2一级精确质量数数据库筛查
    对处理好的样品,首先上机进行一级扫描,然后用已建立好的精确质量数数据库对样品进行筛查。系统对农药的准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等特征与数据库中的理论数据进行比对,筛查出可能存在的农药。农药啶虫脒的提取离子色谱图见图2,其准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度等与理论值的偏差见表1。对于含有同位素原子的化合物,利用谱图中明显的同位素峰,更有利于筛查和确证。如图2和表1显示了啶虫脒的精确质量数和同位素峰,其中[M+H]+的m/z 223.074 7(100%)、225.072 1(34%)的质量相差2,丰度比约为3∶1;[M+Na]+的m/z 245.056 8(100%)、247.053 9(32%)的质量相差2,丰度比约为3∶1,符合化合物中含有1个Cl原子的规律。  
2.3二级谱库确认
    对一级扫描筛查出的农药,在Targeted MS/MS采集界面输入农药的母离子、保留时间和相应的碰撞能量,进行二级数据采集,得到二级谱图。将样品的二级谱图与谱图库中二级子离子谱图进行匹配,达到对疑似农药进行确证的目的。样品中啶虫脒二级谱图比较见图3。     
2.4无二级谱库确认
    并不是每一种农药实验室都会备有标准品,有的标准品不容易买到,如果二级谱库中没有该农药的二级信息,可以参考《世界常用农药色谱-质谱图集-液相色谱-四极杆-飞行时间质谱图集(第二卷)》。如果在该书中也查不到,可以通过MSC解析软件进行结构分析。如图4所示,m/z 189.159 7为[M+H]+母离子,m/z 144.102 3、102.055 7、86.096 8、74.024 7为子离子,母离子、子离子均能与霜霉威相符,因此通过分析可以确定m/z 189.159 7为霜霉威。
2.5方法学验证
     选取3种代表性水果、蔬菜基质(黄瓜,白菜,苹果),分别在5.0、10.0和50.0 μg/kg的添加水平下,向空白基质中添加40种常见农药,然后进行筛
图2农药啶虫脒的提取离子色谱图(a)及质谱图(b)     
Figure 2Extracted ion chromatogram (a) and Mass spectrum (b) of the acetamiprid pesticide     
表1啶虫脒准分子离子的精确质量数、同位素分布和丰度与理论值偏差
Table 1Difference between the inspection value and theoretical value of the exact mass, isotopic distribution and abundance of the
     acetamiprid pesticide    
图3样品中啶虫脒二级谱图比对     
Figure 3Second spectra comparison of acetamiprid in sample
注:化合物结构式虚线部分为掉离的分子基团    
   图4化合物m/z 189.159 7的解析结果     
Figure 4Analytical results of compound m/z 189.159 7 
     查确证。5.0 μg/kg添加水平检出率平均为95%,10.0和50.0 μg/kg添加水平检出率为100%。通过定量计算,90%以上的农药化合物回收率在70%~120%,并且相对标准偏差(RSD)≤20%(n=5)。试验结果说明该方法的灵敏度、准确性和重复性良好,完全能够满足蔬菜、水果中农药多残留的日常筛查与检测。
2.6实际样品的测定
    通过本试验建立的快速筛查与确证蔬菜、水果中的多种农药残留的方法,对30份蔬菜、水果样品进行了筛查与确证。共有25份样品检出农药,检出较多的农药残留有阿维菌素、吡丙醚、苯醚甲环唑、吡虫啉、哒螨灵、敌敌畏、啶虫脒、毒死蜱、对硫磷、多菌灵、戊唑醇、氟虫腈、甲拌磷、抗蚜威、克百威、乐果、马拉硫磷、咪鲜胺、嘧霉胺、灭多威、噻嗪酮、三唑磷、杀螟硫磷、霜霉威、水胺硫磷、烯酰吗啉、氧化乐果等27种农药。对检出的部分农药进行了定量,并依据GB 2763—2014进行了判定,共有2份样品超标,合格率为93.3%(28/30)。
3小结
    本试验建立了超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱法快速筛查与确证蔬菜水果中的多种农药残留方法,通过一级精确质量数数据库比对样品的准分子离子的精确质量数、同位素分布与丰度,对蔬菜水果中农药残留进行初筛,然后通过实际测定样品的二级谱图与二级谱库中谱图进行比对或通过图谱解析方法进行确证。本试验还通过基质加标对该方法进行了验证,并完成了对市售蔬菜水果样品中农药残留的筛查、确证与定量。结果表明,该方法的灵敏度、准确性和重复性良好,并可以在较短的时间内,甚至在没有标准品的情况下,对GB 2763—2014中数百种农药进行筛查与确证,可为食品安全监管提供有效保障。
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