汞和砷的毒性较大，经食物等途径进入人体会对健康造成严重危害。GB 2762—2012《食品安全国家标准 食品中污染物限量》^［1］对食物中汞、砷含量规定了限量指标。历年开展的国家食品安全风险监测都将汞、砷列为重点监测项目。开展食物中汞、砷质量控制样品^［2-3］研制并对参与国家食品安全风险监测的各级检验机构进行能力验证考核，有利于促进实验室技术水平的提高，保障检测汞、砷数据的准确性。2015—2017年在广东省茂名市、汕头市等地渔港采集的16种海鱼中汞、砷的检测结果表明海鱼中汞、砷的存在形态及基体结合形式较复杂，汞、砷含量较高，且即使同网捕捞、品种相同、体型相近的海鱼中汞、砷含量也常会有较大差别。为了保证能力验证考核的实用性，更好地评估相关检验方法的有效性，本研究选择深海网箱养殖的单条大型鞍带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）肌肉直接制备同批海鱼粉质量控制样品，不进行人工添加目标物或稳定剂等特殊处理，使质量控制样品中汞、砷存在形态与实际样品相近。采集单条大型海鱼能更好地控制汞、砷含量的均匀性，以保证成批制备并分装单元量大的质量控制样品的质量。
采集分别在广东省雷州市、湛江市和海南省三亚市附近海域深海网箱养殖的大型鲜活鞍带石斑鱼制备质量控制样品，每批样品取一条鞍带石斑鱼肌肉加工制备而成。在当地市场购买鲜活鱼体，用自来水冲洗干净后宰杀，去鱼鳞、鱼皮和内脏后切割出鲜鱼肌肉，在冷藏条件下立即运送回实验室，在0 ℃冷藏放置过夜后待处理。
350X型电感耦合等离子质谱仪（美国Perkin Elmer Nexion）、DMA80型直接测汞仪（意大利Milestone）、CEM MARS 6型微波消解仪（美国CEM MARS）、Berghef Speedwave 2型微波消解仪（德国Berghef Speedwave）、万分之一天平、恒温干燥箱、电热恒温鼓风干燥箱、电热鼓风干燥箱、绞肉机（绞笼转速106/260 r/min，功率9/11 kW，肉块温度0～5 ℃）、摇摆式高速万能粉碎机（功率900 W，容量200 g，转速25 000 r/min，细度50～200目）、多向运动混合机。　　汞标准储备液（GSBG62069-90，1 000 mg/L，国家钢铁材料测试中心），砷、铝、钡、镉、铬、铜、铅、锡、锌混合标准储备液（GSB04-1767-2004，10.00 mg/L）和金标准储备液（GSB04-1715-2009，1 000 mg/L）均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心，鱼肉中的总汞与甲基汞含量标准物质（GBW10029，中国计量科学研究院），欧盟鱼肉参考物质（ERM-BB422，欧洲标准局Fish Muscle European Reference Materials），硝酸、硫酸均为优级纯，石油醚（分析纯，沸程30～60 ℃）。
将冷藏后鲜鱼肌肉放入绞肉机（绞笼转速为160 r/min，肉块温度保持在5 ℃以下）绞成肉糜，将肉糜平铺在不锈钢盘中（厚度为0.5～1 cm），置于恒温干燥箱中80～85 ℃干燥15 h。样品放冷捣碎后加入1～1.5倍量石油醚（沸程30～60 ℃）进行浸泡脱脂处理，过滤弃去石油醚层。将样品平铺在不锈钢盘中，置于通风柜中挥发除去残存石油醚，再放入恒温干燥箱中85 ℃干燥1 h。在恒温恒湿条件下采用摇摆式高速万能粉碎机（转速25 000 r/min）将样品打成粉末，采用多向混合机充分混匀30 min，再分装为净重约10 g/瓶，置于聚乙烯瓶中拧紧瓶盖密封。样品标记为海鱼粉A、海鱼粉B和海鱼粉C，储存于-4 ℃冷库中^［4-6］。
1.2.2　直接测汞仪测定总汞^［7］将石英样品舟及镍样品舟洗涤干净后放入马弗炉中500 ℃煅烧1 h后备用。制备含量为0、5.00、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 ng/ml的汞标准溶液系列，各准确吸取0.100 ml于石英样品舟中。仪器升温程序为室温至100 ℃，60 s；100 ℃升至200 ℃，30 s；200 ℃升至700 ℃，60 s；700 ℃保持90 s。氧气量为0.4 MPa，汞齐热解时间12 s，记录时间30 s，长池信号读数以峰高计，仪器工作站直接绘制标准曲线。　　称取样品30～100 mg（精确至0.1 mg）于镍样品舟中。仪器升温程序为室温升至200 ℃，20 s；200 ℃保持60 s；200 ℃升至700 ℃，90 s，700 ℃保持90 s，其他条件与石英样品舟绘制标准曲线条件一致。仪器工作站直接计算出汞含量测定结果，同时做空白试验。
1.2.3　电感耦合等离子质谱（ICP-MS）法测定金属污染物^［8］称取样品约0.3～0.5 g（精确至0.1 mg）于微波消解罐中，加入5 ml硝酸，拧紧消解罐上盖放置1 h后消解。升温程序：室温经5 min升至120 ℃，恒温5 min；经5 min升至160 ℃，恒温10 min；经5 min升至190 ℃，恒温20 min。消解后放冷，将消解罐慢慢拧开，置于赶酸器上140 ℃赶酸至约1 ml，样品液转移至50 ml一次性使用塑料管中，用水冲洗消解罐内壁3次并入塑料管中，定容至20 ml，用于测定砷、锰、铁、镍、铜、锌、镉、钡、铅等元素，同时做试剂空白试验。　　仪器操作参数条件为射频（RF）功率1 300 W、等离子体气流量16 L/min、载气流量1.2 L/min、辅助气流量0.97 L/min、氦气流量4～5 ml/min、样品提升速率0.8 r/s、采样深度8～10 mm、扫描方式跳峰、重复次数3。　 由于不同品种海鱼中汞、砷含量差异较大，为确保制备样品含量水平的代表性，在制备前期，开展了海鱼中汞、砷的监测。茂名市地处广东西部，博贺渔港为全国10大渔港之一。该渔港渔船捕捞区域主要集中在珠江口至粤西中浅海渔场，远洋渔船捕捞作业至南海西沙、中沙、南沙群岛各海域。2014年博贺渔港海洋捕捞量为16万吨，位居广东省各渔港镇的捕捞量之首。汕头市地处广东东部，汕头渔船捕捞区域主要集中在粤东至中国台湾浅海渔场，位于南海与东海交界处，2014年汕头市各海港捕捞总量约16.1万吨。两地海产食品捕捞量排名见表1，亦可反映南海海域广东沿海捕捞量的基本情况。
2015—2017年在茂名市和汕头市采集海鱼16种共74份，海鱼油4份。所采集的海鱼包括了捕捞量较高（表1）及历年监测汞、砷含量较高的品种。茂名市采样点分别为水东镇和博贺渔港，汕头市采样点分别为海门渔港、汕头市区和南澳岛。采样环节主要为海港、农贸市场、餐饮店等。采集后的海鱼立即运回当地疾病预防控制中心实验室进行样品预制备后分别放入洁净塑料瓶中，外加洁净塑料袋以防外界污染。样品在-4 ℃下保存，冷藏条件下及时运回本实验室测定。
74份海鱼肌肉中总汞含量范围0.003～1.120 mg/kg，均值0.182 mg/kg；总砷含量范围0.31～32.80 mg/kg，均值4.99 mg/kg，测定结果详见表2^［9-12］。本次调查采集了凤尾鱼油、金枪鱼油、鲨鱼肝油及三文鱼油，海鱼油中总汞含量均较低，范围0.003 2～0.007 2 mg/kg，均值0.004 4 mg/kg。海鱼油中各金属元素仅总砷含量较高，分别为3.69、14.34、4.50及2.26 mg/kg，均值6.20 mg/kg。　　本次测定的74份海鱼肌肉样品中在茂名博贺渔港采集的一份吻沟双髻鲨（Sphyrna lewini）样品汞含量最高，为1.120 mg/kg，但鱼肝油中汞的含量却很低，仅为0.004 mg/kg。说明海鱼中的汞主要蓄积在肌肉中，海鱼脂肪含汞极低。鲨鱼肝脏中的锰、铁、铜、锌、镉高于肌肉中的含量，详见表3。
海鱼肌肉中总汞、总砷的存在形态多样，与基质结合形式复杂。若采用添加汞、砷标准物质制备质量控制样品，往往难以代表检测实际食品的技术难度。同时由于制备技术的局限性，采用添加汞、砷标准物质制备样品的均匀性往往受到影响。选择海鱼自然基质制备质量控制样品，不进行人工添加目标物，保持鱼体中汞、砷等元素代谢结合的基本性质，且样品均匀性较好。采用该样品实施能力验证计划可更好地评估相关检验方法的准确性。
海鱼肌肉中总汞、总砷含量相对较高，但因品种不同差异较大。即使同一品种中的总汞、总砷含量波动也会较大（表2）。本研究在茂名市、汕头市等地海港分别采集同网捕捞、品种相同、体型接近的鲳鱼、鲻鱼、金线鱼、马鲛鱼等海鱼，每种4～5条，测定每条鱼中总汞、总砷含量。4种海鱼中总汞、总砷含量的相对标准偏差（RSD）分别为5.95%～31.5%和13.0%～49.1%，详见表4。提示，即使同网捕捞、品种相同、体型接近的海鱼中总汞、总砷的含量在每条海鱼之间可能也会有较大差别，即存在明显的不均匀性问题。若采用多条同品种海鱼制备同批质量控制样品在确保目标物均匀性方面有较大的难度。 　　在茂名市、汕头市等地海港分别采集鲨鱼、红烟管鱼、石斑鱼、马鲛鱼、海鳗、带鱼等样品，在同一条鱼中分别取背部肌肉和尾部肌肉测定总汞、总砷含量的RSD分别为1.45%～6.00%和1.58%～10.80%，详见表5。提示，在质量控制样品目标物均匀性方面，采用同条海鱼制备比采用多条相同品种海鱼更有优势。
表2列出了各种海鱼的体型情况及总汞、总砷含量范围。由于本次制备的质量控制样品所需单元量很大，综合考虑后确定以大型鲜活鞍带石斑鱼为样品。采集3条分别在广东省雷州市、湛江市碯洲岛和海南省三亚市附近海域深海网箱养殖的鞍带石斑鱼，取肌肉为原材料分别加工制备成海鱼粉A、海鱼粉B和海鱼粉C三批质量控制样品（表6），制备过程严格按照实验室内部研制质量控制样品指南操作^［3,12］。值得注意的是网箱养殖海鱼肌肉中的脂肪含量相对较高，鱼肌肉干燥后需采用石油醚浸提除去脂肪。石油醚加入比例依据鱼肌肉脂肪含量而定，本次制备石油醚加入量为肌肉量的1～1.5倍，可根据海鱼肌肉中脂肪含量适当调节石油醚使用量。石油醚加入比例过低脱脂效果不理想，制备后的样品存在色泽不均、容易结团等问题。石油醚比例过高则造成浪费。另外，由于质量控制样品的制备量较大，采用真空冷冻干燥方式有一定难度，经试验证实鱼肉糜在常压下90 ℃干燥不会导致鱼肉中汞的挥发损失，故采用90 ℃直接干燥样品。
采用直接测汞（DMA）法测定海鱼粉中总汞含量，微波消解-ICP-MS法测定总砷含量，测定结果见表7^［8,11］。同时测定欧盟鱼肉参考物质（ERM-BB422）和鱼肉中总汞和甲基汞标准物质（GBW10029）进行对比试验，GBW10029总汞均值在标示值［（0.85±0.03）mg/kg］范围内，该样品没有标示总砷含量。ERM-BB422的总汞、总砷均值也在标示值［（0.601±0.030）和（12.7±0.7）mg/kg］范围内。表7　海鱼粉样品与标准物质中总汞、总砷含量测定结果Table 7　Determination results of total mercury and arsenic of QCMs and CRMs;注：—为无测定结果
　　样品均匀性检查采用单因子方差分析^［12-17］。从海鱼粉A、B、C三批质量控制样品中分别随机抽取10份进行均匀性试验，每份样品做2次平行测定，数据分析结果见表8。海鱼粉A、B、C中总汞和总砷的F值均0.05（9,10），表明海鱼粉A、B、C中总汞和总砷含量是均匀的。将3批样品分别发送到两家技术支持机构进行应用检验，试验结果表明样品的均匀性良好。 　　样品的均匀性检查结果可作为稳定性检查的第一次数据。将3批海鱼粉在室温条件下分别放置20 d和4个月后各抽取样品，采用t检验进行第二次和第三次稳定性检查^［13-18］。试验结果（表9）可判定第二次和第三次检测值与第一次检测值之间差异无统计学意义［t0.05(24)］，说明室温贮存条件下4个月内，海鱼粉样品中总汞和总砷含量稳定性良好。将3批海鱼粉分别抽取2瓶，随同能力验证发样时邮寄给国内两家不同的参加实验室，请其收到样品后原包装寄回，然后进行飞行运输稳定性检查，试验结果也表明样品稳定性良好。稳定性检查结果表明，在本轮能力验证期间，样品中总汞、总砷含量不会发生变化。

表9　测定海鱼粉中总汞、总砷含量稳定性试验数据（±s） Table 9　Evaluation of the stability of QCMs

受国家食品安全风险评估中心委托，2016年本实验室实施了项目编号为HMRL1601的海鱼粉中总汞、总砷检测能力验证计划^［19］。该计划采用海鱼粉A、B、C作为测试样品，对全国范围内193个承担食品安全风险监测的疾病预防控制机构实施能力验证。本实验室根据海鱼粉研制过程的检测技术要点为参加实验室提供了能力验证作业指导书^［20-21］。
对各参加实验室反馈的海鱼粉A、B、C样品中总汞、总砷检测结果进行统计，采用稳健（Robust）统计技术的中位值为指定值，标准化四分位距（NIQR）作为评定标准差。按下式计算Z值：（x-X）/NIQR，式中x为该实验室检测结果；X为所有实验室检测结果的中位值；IQR=Q₃-Q₁，NIQR=0.7413×IQR。根据Z值评价参加实验室的检测结果，即：│Z│≤2为满意结果;2<│Z│<3为有问题结果；│Z│≤3为不满意结果^［22-23］。本次能力验证计划共有190家实验室参加了海鱼粉中总汞检测，192家实验室参加了海鱼粉中总砷检测。统计结果表明总汞和总砷检测结果的满意率分别为81.1%(154/190)和80.2%(154/192)。
参加本次能力验证计划的实验室主要采用ICP-MS法和原子荧光光谱（AFS）法测定总砷含量，满意率分别为92.6%（50/54）和79.0%（109/138）。部分实验室选用GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》^［10］第一篇第二法AFS法进行测定，但却未按该标准规定的样品前处理方法，而是采用微波消解，由于海鱼粉消解不完全导致采用AFS法测定总砷的结果偏低。　　总汞含量测定主要采用DMA、ICP-MS和AFS法。3种检测方法的满意率分别为96.0%(24/25)、88.6%(31/35)和76.2%(99/130)，采用DMA法测定总汞的满意率最高。GB 5009.17—2014《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》^［11］第一篇第一法AFS法测定采用微波消解样品，所推荐的消解程序对海鱼粉消解不完全，导致采用AFS法测定总汞的满意率较低。建议对GB 5009.17—2014进行修订，增加DMA法并对AFS法的前处理进行改进。　　 本研究在对海鱼中总汞、总砷含量分析的基础上，选择同条海鱼肌肉为原料制备同批质量控制样品，不进行人工添加目标物或稳定剂制备质量控制样品，经均匀性和稳定性检查，制备的质量控制样品性能良好。应用所制备的样品对193个实验室实施了能力验证考核，为国家食品安全风险监测提供了有力的技术支持。