汞是环境中广泛存在的持久性有毒污染物，通过工业“三废”排入自然环境中，造成空气、水体、土壤、植物等污染，其生物体毒性取决于浓度及其形态。环境中金属汞经消化道吸收很少，而在微生物作用下转化成的有机汞具有脂溶性，容易被生物体吸收^［1］，并可通过食物链富集^［2］最终进入人体。其代谢周期长，蓄积于肝、肾、脑中，小剂量蓄积也可对人体健康造成严重影响^［3］，主要为神经毒性，表现为精神和行为障碍，因此，食品中汞及其形态分析尤为重要，GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》^［4］对水产动物及其制品的甲基汞限量为0.5 mg/kg，对肉食性鱼类及其制品的甲基汞限量为1.0 mg/kg，欧盟对水产品的总汞限量与国标的甲基汞限量一致。　　目前，汞形态分析常用的方法有液相色谱-电感耦合等离子体质谱（LC-ICP-MS）法^［5-6］、液相色谱-原子荧光光谱（LC-AFS）法^［7］、气相色谱-质谱（GC-MS）法^［8-9］等，其中以高灵敏度的电感耦合等离子体质谱作为检测器，液相色谱作为分离系统，两者结合而成的LC-ICP-MS联用技术已成为汞形态分析的最有效的方法^［6］。本试验采用不同浓度的HCl溶液进行超声辅助提取，以L-半胱氨酸为离子对试剂，建立了鱼肉中3种汞形态的LC-ICP-MS测定法。方法的各项分析性能指标，包括精密度、准确度、检出限等均满足痕量汞形态分析的要求，本方法在精密度、检出限等方面优于现行GB 5009.17—2014《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》中第二篇食品中甲基汞的测定^［10］（液相色谱-原子荧光光谱联用方法），在前处理中不用酸浸泡过夜，缩短了前处理时间，并且可同时对3种汞形态进行定性定量分析。
　Agilent 7500cx电感耦合等离子体质谱仪、Agilent 1260液相色谱仪均购自美国Agilent，PURELAB PULSE纯水/PURELAB ULTRA超纯水系统（英国LEGA），KQ-500DA数控超声波清洗器，高速离心机。　　甲基汞（GBW08675，MeHg）、乙基汞［GBW（E）081524，EtHg］、汞标准溶液（BW085523）、鱼肉中总汞与甲基汞含量标准物质（GBW10029）均购自国家标准物质中心，甲醇（色谱纯），盐酸、乙酸铵（浓度≥99%）、L-半胱氨酸（浓度99%）均为优级纯，氨水（分析纯）。
　二价汞(Hg²⁺)标准储备液（10 mg/L）：量取0.1 ml汞标准溶液用1%HCl溶液定容至10 ml，于4 ℃冰箱中避光保存，可保存1个月。　　甲基汞标准储备液（10 mg/L）：称取1.526 7 g甲基汞标准品，用甲醇定容至10 ml，于4 ℃冰箱中避光保存，可保存1个月。　　乙基汞标准储备液（10 mg/L）：称取1.308 9 g乙基汞标准品，用甲醇定容至10 ml，于4 ℃冰箱中避光保存，可保存1个月。　　混合标准应用液：临用前，用流动相稀释配制成100 μg/L的混合标准应用液。　　标准系列溶液：分别吸取100 μg/L的混合标准应用液10、20、50、100、200 μl至进样瓶中，各自加入990、980、950、900、800 μl的流动相，配制成浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的标准系列，标准系列应现用现配。
　　称取鱼肉1 g（精确到0.001 g）于10 ml离心管中，加入5 ml 0.01 mol/L HCl溶液，充分振摇后超声提取30 min，4 ℃ 8 000 r/min离心10 min，收集上清液于10 ml比色管中，再加入5 ml 5 mol/L HCl提取一次，合并上清液，混匀后取2 ml置于另一10 ml比色管中，逐滴加入氨水调pH至弱酸性，加入0.2 ml 10 g/L L-半胱氨酸，并定容至5 ml，经0.45 μm滤膜过滤后待测。同时进行空白试验。
　质谱：射频功率1 500 W，载气流速0.8 L/min，采样锥为镍锥（孔径1.0 mm），截取锥为镍锥（孔径0.4 mm），雾化室温度为（2±0.1） ℃，玻璃同心雾化器，雾化器泵速为0.3 r/min；采用时间分辨分析（time resolved analysis）模式。　　色谱：色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C₁8（4.6 mm×150 mm，5 μm），流速0.8 ml/min，进样量10 μl，流动相：A相为10 mmol/L乙酸铵-0.12% L-半胱氨酸，B相为甲醇。　　 　　张兰等^［11］通过比较不同乙酸铵浓度和L-半胱氨酸浓度，认为当乙酸铵浓度为10 mmol/L、L-半胱氨酸浓度为0.12%时，流动相条件较佳。本试验发现，流动相pH和乙酸铵缓冲盐浓度（10、20、40 mmol/L）对各形态的分离效果影响较小。在C₁8反相色谱中，添加络合剂或离子对试剂与汞形成非极性化合物后能有利于化合物的色谱分离，本方法选用L-半胱氨酸作为离子对试剂，其浓度为0.12%。　　随着甲醇比例的降低（10%→8%→5%→3%），出峰时间延长，柱压增加，基线噪声逐渐变大，但可改善甲基汞和Hg²⁺的分离效果。本方法综合分析时间和基线噪声后选择的流动相为甲醇和10 mmol/L 乙酸铵-0.12% L-半胱氨酸（5∶95，V/V）。为了防止溶剂倒峰对Hg²⁺峰型的干扰，本方法用流动相稀释标准和样品，能有效降低甚至消除溶剂峰，见图1。
　　汞形态分析中常见的前处理方法有微波辅助提取法^［12］、超声辅助酸/碱提取法^［13］等，利用微波、超声等辅助手段使酸/碱等提取液将蛋白质溶解后析出各种汞形态。不同提取方法其元素形态间转化率和提取率有所差别。试验发现，蛋白质遇高浓度强酸/强碱会变性凝固成团，造成提取时间延长和提取效率降低；为了防止变性凝团，将蛋白质冷冻干燥后磨碎，再进行提取，可明显提高溶解效果，但同时增加了交叉污染和损失的风险。文献^［14］显示，随着pH值的降低，蛋白质溶解率逐渐增加，pH=2.39时达到最大，然后溶解率又逐渐降低。鉴于此，本方法对超声辅助酸提取法进行了优化，比较了不同浓度的HCl对提取时间和提取效果的影响。　　首先考察了5 ml不同浓度HCl（5、0.1、0.01、0.001 mol/L）和纯水的单次超声提取的效果。试验发现，纯水提取1 h后，样品仅有少量溶解，之后没有变化；4种不同浓度的HCl溶液提取4 h以上，蛋白质溶解情况相似，而在1 h内，5 mol/L HCl溶解效果最差，0.01 mol/L HCl溶解效果最好。进一步比较了10 ml 5 mol/L HCl（60 min）、5 ml 5 mol/L HCl+5 ml 5 mol/L HCl、5 ml 0.01 mol/L HCl+5 ml 5 mol/L HCl、5 ml 5 mol/L HCl+5 ml 0.01 mol/L HCl在30 min+30 min内的提取效果，结果见表1。先使用5 ml 0.01 mol/L HCl提取30 min，再用5 ml 5 mol/L HCl提取30 min，两次酸提取明显改善了提取效率。
由于样品最终的酸度将影响其稳定性，通过试验发现，碱性条件下，Hg²⁺回收率偏低，原因可能是Hg²⁺不稳定，转化为HgO，因此，通过滴加氨水调pH=5～7，可有效提高Hg²⁺的回收率，见表2。
　3种汞化合物按照1.2.1配制的标准系列进行测定，相关系数均>0.999。以3倍基线噪声（S/N=3）对应的3种汞形态的浓度表示检出限，Hg²⁺、甲基汞、乙基汞的检出限分别为3.2、3.7和6.2 μg/kg，其定量限分别为10.7、12.3和20.7 μg/kg。
　由于天然鱼肉中汞形态主要为甲基汞^［15］，Hg²⁺和乙基汞通常低于检出限，因此，重复性试验是对某样品做7份加标平行样（6 μg/L），连续进样，以峰面积计算相对标准偏差(RSD)，Hg²⁺、甲基汞、乙基汞的RSD分别为4.7%、3.1%、3.4%。
　在鱼肉样品中分别加入低、中、高3种浓度的混合标准应用液进行测定，结果见表3，Hg²⁺、甲基汞、乙基汞的回收率分别为82%～93%、94%～99%、90%～97%之间。并对鱼肉的标准物质（GBW10029）进行测定，结果在证书值范围内，见表4，图2为鱼肉标准物质及其加标的色谱图。 　随机选择5种市售海鱼，采用本方法进行检测，均检出微量甲基汞（13.1～52.7 μg/kg），其中一份样品检出Hg²⁺（19.4 μg/kg），所有样品均未检出乙基汞。　　 　通过优化色谱分离条件，采用两步提取的前处理方法，提高了3种汞形态的提取效率。本方法准确灵敏、简单稳定，适用于鱼肉中痕量汞形态的分析。