DOi:10.13590/j.cjfh.2017.06.002 
利用全基因组序列优化气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法 
陈洪友,陈敏,屠丽红,陈涌,张曦

(上海市疾病预防控制中心,上海200336)

收稿日期:2017-08-15

作者简介:陈洪友男副主任医师研究方向为致病性弧菌检测E-mail:chenhongyou@scdc.sh.cn    
通信作者:张曦女主任医师研究方向为病原微生物的实验室检测E-mail:zhangxi@scdc.sh.cn

基金项目:上海市第四轮公共卫生三年行动计划高端海外研修团队培养计划(GWTD2015S01);“十三五”国家传染病防治科技重大专项(2017ZX10103009-003)

摘要:目的对气单胞菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法从限制性内切酶的选择和电泳条件设置上进行优化,减少片段共迁移,使片段在电泳中分布均匀且利于分析。方法利用6个种的气单胞菌的全基因组数据,通过BioEdit软件对基因组序列进行677种酶的限制性片段分析,选择产生片段数量适宜的、有效片段比例高的酶作为备选酶。对片段长度取以10为底的对数作为自变量,以片段在泳道中的相对迁移距离作为应变量,计算片段长度-相对位置拟合公式,并模拟备选酶的电泳效果图。利用气单胞菌分离株对备选酶进行试验验证,确定PFGE分型方法,并用其对腹泻分离株进行分型应用。结果经BioEdit分析,根据片段数量及有效片段比例,PmeⅠ、PacⅠ、SwaⅠ比XbaⅠ更适合于气单胞菌的分型。从PFGE模拟效果及分离株试验验证看,PacI、PmeⅠ的限制性片段的分布比XbaⅠ和SwaⅠ更均匀,片段重叠更少。最终确定PmeⅠ、PacⅠ分别为气单胞菌PFGE分型的首选酶和次选酶,脉冲场电流转换时间为2.16~63.8 s。16株腹泻分离株PFGE分型辛普森多样性指数为99.17%。结论优化的PFGE方法使用PmeⅠ、PacⅠ作为气单胞菌PFGE分型的限制性内切酶,该方法产生的片段数量与分布都优于XbaⅠ,在腹泻分离株的分型中能获得良好的分辨率。此研究提供的优化程序可用于其他细菌PFGE方法的建立或优化。
关键词: 气单胞菌; 脉冲场凝胶电泳; 限制性内切酶; 全基因组序列; 食源性致病菌; 分型
文章编号:1004-8456(2017)06-0641-06     中图分类号:R155文     文献标志码:A    
Using whole genome sequences to optimize pulsed field gel electrophoresis typing      method for Aeromonas
  CHEN Hong-you, CHEN Min, TU Li-hong, CHEN Yong, ZHANG Xi
(Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention,Shanghai 200336,China)
Abstract:ObjectiveThe pulsed field gel electrophoresis (PFGE) typing method of Aeromonas was optimized from aspects of restriction enzymes and electrophoresis parameters, which reduced fragments co-migration and made them well-distributed for easily analyzing. MethodsUsing whole genome sequences of 6 Aeromonas, restriction fragments produced by 677 enzymes were analyzed in BioEdit software. Enzymes producing more effective fragments in appropriate number were selected, and the fitting curve and regression equation were derived from the length of restriction fragments represented as denary logarithm and the relative position of fragments in gel represented as fragments migration distance percentage of the valid length of the reference system. Digital simulation of pulsed field gel electrophoresis map was shown when length of fragments from different Aeromonas substituted into the equation. Results of digital simulation were also verified by PFGE typing assay with selected enzymes for Aeromonas typing. Isolates from diarrhea patients were subtyped by the optimized new method. ResultsBioEdit analysis result showed PmeⅠ , PacⅠand SwaⅠ were better than XbaⅠ as enzymes for PFGE from the aspects of total and effective number of restriction fragments. According to the result of PFGE simulation and the verification test of isolates, the distribution of fragments of PacⅠ and PmeⅠ was better distributed and less overlapped than those of XbaⅠ and SwaⅠ . Finally, PmeⅠ and PacⅠ were selected as the first and second choice of enzymes for PFGE typing, and the pulsed field conversion time was set as 2.16-63.8 s. Sixteen isolates from diarrhea patients were subtyped by new method, and the Simpson diversity index was 99.17% according to the typing result. ConclusionAs enzymes used in PFGE typing, PmeⅠ and PacⅠ were better choices than XbaⅠ , and good resolution was obtained from subtyping of isolates from diarrhea. The procedure for optimizing PFGE typing method provided in this study is applicable to the establishment or optimization of other bacteria‘s PFGE typing method.
Key words: Aeromonas; pulsed field gel electrophoresis; restriction enzyme; whole genome sequence; food contaminant; typing
       气单胞菌广泛存在于环境与食品中,已知有11个种可通过污染的水或食品引起人类疾病,有时还可引起食物中毒[1-2]。在对气单胞菌引起的疾病进行暴发监测或在暴发中进行溯源时,因其来源多样,需采用分辨率高的分型技术。脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)作为一种分辨率高、结果再现性好的分型方法,被广泛应用于细菌性疾病暴发的监测[3]。BORCHARDT等[4]首次在一起气单胞菌引起的腹泻暴发中以XbaⅠ作为限制性内切酶对气单胞菌进行PFGE分型,并获得良好的分辨率,此后众多研究也多采用XbaⅠ做为气单胞菌PFGE分型的内切酶。
        根据PFGE图谱的解读原则,PFGE是通过限制性酶切片段(条带)的变化来反映菌株之间的遗传事件[5]。PFGE分型常以沙门菌H9812(Salmonella ser.branderup)的XbaⅠ酶切片段作为DNA片段长度参照,长度处于该参照体系范围内的标本片段被认为是有效片段,理想的PFGE图谱其全部的酶切片段应均为有效片段,并且不同片段间在长度上应保持必要的差异,以保证电泳时条带之间不发生重叠且易于区分,进而能通过条带的变化对菌株的变异进行解释。以XbaⅠ作为气单胞菌PFGE分型酶,产生的片段有相当数量为无效片段,且有效条带主要集中于20~400 kb范围内,易造成片段重叠,故较难有效反映菌株之间的遗传关系。
此次研究利用已公布的气单胞菌的全基因组序列,以酶切片段数量、有效片段比例和电泳中片段的分布作为筛选限制性内切酶和改进电泳条件的主要因素,从方法设计上尽可能保证图谱能反映菌株之间的遗传关系,并使分型图谱更易于观察、比对。
1材料与方法
 1.1材料
1.1.1参考序列与验证菌株来源
        6个种的气单胞菌全基因组序列从GenBank下载,种名、菌株号与序列登录号如下:亲水气单胞菌(A.hydrophila,ATCC 7966,NC_008570)、豚鼠气单胞菌(A.caviae,FDAARGOS_72,GCA_000783775)、维隆气单胞菌(A.veronii,B565,NC_015424)、中间气单胞菌(A.media,WS,NZ_CP007567)、杀鲑气单胞菌(A.salmonicida,A449,NC_009348)、舒伯特气单胞菌(A.schubertii,WL1483,NZ_CP013067)。
用于PFGE验证的气单胞菌菌株分离自医院肠道门诊腹泻患者粪便,标本采集于2015年1~6月。 
1.1.2主要仪器与试剂
        脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad),限制性内切酶XbaⅠ、PmeⅠ、PacⅠ均购自美国NEB,蛋白酶K[宝生物工程(大连)有限公司],CHROMagarTM弧菌显色琼脂(法国科玛嘉)。
1.2方法
1.2.1基因组酶切位点分析与限制性内切酶的选择
        利用BioEdit软件(V7.0.9.0)对气单胞菌基因组序列进行677种酶的酶切位点查找,排序各酶的酶切频率。选择酶切片段数量适中,且有效片段比例高的酶作为PFGE分型试验的备选酶,并与XbaⅠ进行比较。
1.2.2限制性片段电泳分离效果的模拟
        以沙门菌H9812的XbaⅠ酶切片段作为DNA片段迁移距离参照,设最大片段(1 135 kb)在泳道上的位置为0%,设最小片段(20.5 kb)在泳道上的位置为100%,其他片段以其在泳道中的迁移距离百分比作为片段的相对位置。在脉冲时间为2.16~63.8 s且电泳时间为18.5 h的电泳条件下,对H9812的各片段长度取以10为底的对数作为自变量(X),以片段的相对位置作为应变量(Y)进行二项式拟合,获得回归方程。将各备选酶酶切6种气单胞菌产生的片段长度取对数代入回归方程,计算片段的相对位置,据此绘制模拟电泳图,以观察气单胞菌酶切片段在电泳中的分布。选择片段分布均匀、重叠少的酶用于气单胞菌的PFGE分型试验。
1.2.3PFGE分型
        菌株接种5%绵羊血平板35 ℃培养24 h,直接取培养物配制成约4个麦氏浊度单位的菌悬液用于凝胶包埋和细胞消化。酶切后电泳的脉冲时间为2.16~63.8 s,电泳时间为18.5 h。PFGE分型其他操作参照BORCHARDT等[4]的报道。以辛普森多样性指数(Simpsons diversity index,DI)描述气单胞菌腹泻分离株PFGE型的多样性,计算公式如下: 其中,N代表测试个体的总数,n代表各型中个体数量,i代表不同的型。
 1.2.4验证菌株的分离与鉴定
        粪便标本直接接种CHROMagarTM弧菌显色琼脂平板进行分离培养。每个平板挑选5个可疑菌落,参考既往报道使用属特异性16S rRNA基因引物进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定[6],目标片段长度为461 bp。
2结果
2.1基因组限制性片段分析
        6种气单胞菌基因组的酶切频次显示,频次最少的10种酶中,用于对照的XbaⅠ多位于第5位,其在各基因组中的酶切频次从72至107不等。从频次上看PacⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ均低于XbaⅠ,产生的片段数量为9~36条,SpeⅠ则≤XbaⅠ,此4种酶可作为气单胞菌PFGE分型的备选酶,见表1。其他酶对至少一种气单胞菌的酶切频次要高于XbaⅠ,如FseⅠ、SnaBⅠ,或者对至少一种气单胞菌酶切频次超过100次,如MluⅠ、SanDⅠ等,考虑到PFGE凝胶的有限的分离距离仅约10 cm,故不采用其为PFGE分型的备选酶。
    表1各气单胞菌基因组酶切频次最少的10种限制性内切酶及其酶切频次
        Table 1First 10 enzymes of least frequency for each Aeromonas genome and their genome cutting frequency   
        从各酶酶切6种气单胞菌产生的总有效片段占总酶切片段数的比例看,PmeⅠ(86.8%,66/76)>PacⅠ(81.8%,90/110)>SwaⅠ(80.1%,141/176)>SpeⅠ(68.0%,232/341)>XbaⅠ(62.6%,342/546),见表2。除豚鼠气单胞菌外,SpeⅠ和XbaⅠ酶切其余5种气单胞菌产生的无效小片段(<20.5 kb)在各基因组中占25.0%~45.8%,即有约1/4到1/2的片段不能用于反映菌株间的遗传关系,故不考虑SpeⅠ作为PFGE分型酶,因此PmeⅠ、PacⅠ、SwaⅠ相对更适合于气单胞菌的分型。
2.2限制性片段电泳分离效果的模拟
        据H9812的酶切片段长度对数与相对位置,得回归方程Y=-22.19X2+37.64X+89.07,R2=0.997。将酶切片段长度对数代入回归方程得条带的相对迁移距离推测值(Y1),推测值与实测值(Y0)大致相当,该回归方程可用于推测气单胞菌各酶切片段在同样电泳条件下的迁移位置,见表3。
        将XbaⅠ、PacⅠ、PmeⅠ、SwaⅠ酶切6种气单胞菌产生的片段的长度取对数分别代入回归方程,根据其相对位置绘制PFGE模拟图。模拟图显示(图1),在条带分布上XbaⅠ的片段集中于凝胶的下部,PacⅠ、PmeⅠ的限制性片段均匀分布于整个泳道。从片段的重叠情况看,PmeⅠ<PacⅠ<SwaⅠ<XbaⅠ,SwaⅠ的片段在部分位置发生重叠。根据模拟效果,PacⅠ和PmeⅠ更适合于气单胞菌的PFGE分型,且PmeⅠ要优于PacⅠ,两者可分别作为气单胞菌PFGE分型的首选酶和次选酶。
2.3分离株的PFGE验证与应用
        2015年从8份粪便标本中检出16株气单胞菌,取其中3株作为PFGE方法的验证菌株。XbaⅠ酶切后,3株菌的大部分条带均位于凝胶中部以下,有效片段长度范围约为20~250 kb,且在33.3~104.5 kb之间有大量片段因共迁移发生重叠,难以分辨条带确切位置,见图2-A。针对重叠位置的条带,调整电泳条件,设置脉冲转换时间为0.5~20 s,以减少大片段泳动距离,增加小片段的分离效果后,片段基本能充满凝胶大部分,小片段分离效果有所改善,但在33.3~104.5 kb之间仍有大量条带集聚,片段共迁移现象并未明显改善,见图2-B。分离株的电泳验证提示,XbaⅠ并不适合作为气单胞菌PFGE分型的限制性内切酶,其产生的片段长度范围比较狭窄,经调整脉冲场电泳参数,能使该狭窄范围内的片段最大限度的分布到整个凝胶上,但因其数量过多,不可避免的大量条带发生重叠。
        验证菌株以PacⅠ和PmeⅠ酶切后电泳结果显示,在电泳脉冲转换时间为2.16~63.8 s、电泳时间为18.5 h的条件下,3株气单胞菌酶切后片段长度范围约在20~1 135 kb,条带数量适中,平均约为11~13条,且在凝胶中分布均匀,条带位置明确,部分菌株有片段共迁移现象,但并不普遍,见图3。

        表25种限制性内切酶酶切6种气单胞菌基因组的限制性片段分布
        Table 2Distribution of restriction fragments from 6 Aeromonas species digested by 5 enzymes    
     表3内参照沙门菌H9812的XbaⅠ限制性片段长度及其相对迁移距离实测值与推测值
         Table 3Restriction fragments length of H9812 digested by  XbaⅠand their measured and predicted relative migration distance
          注:X为片段长度以10为底的对数值;Y0为片段的相对位置实测值 ;Y1为根据回归方程推算的片段相对位置推测值 
     注:M:沙门菌H9812基因组的XbaⅠ限制性片段,作为条带迁移距离参照;1~6:气单胞菌基因组酶切片段,依次为亲水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、中间气单胞菌、杀鲑气单胞菌、舒伯特气单
         胞菌、维隆气单胞菌
         图16种气单胞菌以4种酶酶切的PFGE模拟
         Figure 1PFGE simulation of 6 Aeromonas species digested by 4 enzymes

         注:M:沙门菌H9812基因组的XbaⅠ酶切片段;1~3:气单胞菌分离株,依次为PX15037-1、PX15094、PX15206
         图23株气单胞菌分离株经XbaⅠ酶切后的片段在不同电泳条件下的分离效果
         Figure 2PFGE results of 3 Aeromonas isolates digested by XbaⅠwith different electrophoretic parameters    
      注:M:沙门菌H9812基因组的XbaⅠ酶切片段;1~3:气单胞菌分离株,依次为PX15037-1、PX15094、PX15206
          图33株气单胞菌分离株经PacⅠ与PmeⅠ酶切后产生的片段的电泳分离结果
          Figure 3PFGE results of 3 Aeromonas isolates digested by PacⅠ and PmeⅠ 
从验证试验结果看,PacⅠ和PmeⅠ均可用于气单胞菌的PFGE分型。
        PmeⅠ对分离株进行PFGE分型的结果显示,16株气单胞菌共分为15个PFGE型,来自不同标本的分离株其PFGE型别不同。除1份标本(PX15037)中有2株分离株PFGE型别不可区分外,其他来自相同标本的菌株PFGE型别均不相同,见图4。以PFGE分型结果计算辛普森多样性指数为99.17%,气单胞菌以PmeⅠ进行PFGE分型可获得良好的分辨率。    
    注:相同的符号表示菌株来自相同的标本
        图4PmeⅠ酶切气单胞菌腹泻分离株的PFGE聚类分析
         Figure 4Dendrogram of PFGE results of Aeromonas isolates from diarrhea patients digested by PmeⅠ    
3讨论
        通过对不同种的气单胞菌的全基因组序列进行各种酶的酶切频次分析,确定备选酶,然后通过片段长度-电泳迁移距离的数学拟合,模拟备选酶的电泳效果以观察酶切片段分布,并通过菌株验证最终确定PFGE分型的内切酶。PFGE模拟效果与分离株验证结果显示,在脉冲转换时间为2.16~63.8 s、电泳时间为18.5 h时,PacⅠ和PmeⅠ酶切气单胞菌基因组产生的片段数量适中,在凝胶中分布均匀,且少有重叠,因此以PacⅠ和PmeⅠ代替XbaⅠ可优化气单胞菌PFGE分型方法。
        有研究[7-8]XbaⅠ酶切的基础上对气单胞菌PFGE的电泳条件进行调整,图谱在单张或少量图谱间尚可比对,但不利于大规模暴发或长期监测获得的大量图谱的比对分析。此次研究的验证结果也显示,XbaⅠ产生的片段在凝胶中的分布并不能通过调整电泳条件得以有效改善,故对于气单胞菌的PFGE分型,XbaⅠ并非最佳选择。
        对于不同的细菌,PFGE分型方法的区别主要在于限制性内切酶的选择和电泳条件的设定。此次研究提供的优化方法避免了在内切酶选择及电泳参数确定时的大量尝试性试验操作,减少了时间及试剂的消耗。该方法可以同样用于其他细菌PFGE方法的建立或优化。
        除了分辨率高、结果再现性好外,PFGE作为一种成功应用于多种细菌性疾病监测的分子分型技术,还具有实验室网络成熟的优点,目前仍被广泛使用[9]。优化后的方法对16株分离株的分型结果显示出良好的分辨率,但任何细菌的PFGE分型方法的确立都不应仅仅局限于实验室,而应与流行病学调查相结合。此研究中分离株的分型结果显示出腹泻病例标本中气单胞菌构成的复杂性,提示在怀疑暴发由气单胞菌引起时,应挑选多个可疑菌落对其分型,以确定何种型别引起暴发,而不能简单的以单个菌落的分型结果来下结论。
参考文献
 [1]李振涛,郑浩. 一起嗜水气单胞菌食物中毒的流行病学调查[J]. 江苏预防医学,2015,26(6):90-91.
[2]KHAJANCHI B K, FADL A A, BORCHARDT M A, et al. Distribution of virulence factors and molecular fingerprinting of Aeromonas species isolates from water and clinical samples: suggestive evidence of water-to-human transmission[J]. Appl Environ Microbiol,2010, 76(7):2313-2325.
[3]BESSER J. Pulsed-field gel electrophoresis for disease monitoring and control[J]. Methods Mol Biol,2015,1301:3-7.
[4]BORCHARDT M A, STEMPER M E, STANDRIDGE J H. Aeromonas isolates from human diarrheic stool and groundwater compared by pulsed-field gel electrophoresis[J]. Emerg Infect Dis, 2003, 9(2):224-228.
[5]TENOVER F C, ARBEIT R D, GOERING R V, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(9):2233-2239.
[6]PERSSON S, AL-SHUWELI S, YAPICI S, et al. Identification of clinical Aeromonas species by rpoB and gyrB sequencing and development of a multiplex PCR method for detection of Aeromonas hydrophila, A.caviae, A.veronii, and A.media[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(2):653-656.
[7]VILLARI P, CRISPINO M, MONTUORI P, et al. Molecular typing of Aeromonas isolates in natural mineral waters[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(1):697-701.
[8]EROVA T E, SHA J, HORNEMAN A J, et al. Identification of a new hemolysin from diarrheal isolate SSU of Aeromonas hydrophila[J]. FEMS Microbiol Lett, 2007, 275(2):301-311.
[9]PARIZAD E G, PARIZAD E G, VALIZADEH A. The application of pulsed field gel electrophoresis in clinical studies[J]. J Clin Diagn Res, 2016, 10(1):DE01-DE04.