DOi:10.13590/j.cjfh.2017.06.003 
2015年分离自中国大陆食品的1 070株沙门菌耐药性分析 
胡豫杰1,王伟1,闫韶飞1,甘辛1,吕涵阳1,刘畅2,杨大进1,李凤琴1,徐进1    

(1.国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室,北京100021;      2.北京农学院食品科学与工程学院,北京102206)

收稿日期:2017-09-12

作者简介:胡豫杰男助理研究员研究方向为食源性沙门菌E-mail:huyujie@cfsa.net.cn    
通信作者:徐进男研究员研究方向为食品微生物E-mail:xujin@cfsa.net.cn

基金项目:国家重点研发计划(2016YFD0401102);国家食品安全风险评估中心青年科研基金(2017005);国家食品安全风险评估中心高层次人才队伍建设523项目-食品分类人才培养项目(2017人才-3-11)

摘要:目的了解我国2015年食源性沙门菌的耐药状况及mcr-1基因在硫酸粘菌素(conlistin,CT)耐药菌株中的分布情况。方法采用微量肉汤稀释法测定1 070株食源性沙门菌对10类16种抗生素的药物敏感性,采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法检测196株CT耐药菌株中是否存在mcr-1基因。结果71.9%(769/1 070)的沙门菌对受试的16种抗生素呈现不同程度的耐药性,其中萘啶酸(NAL)、四环素(TET)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)4种抗生素的耐药率较高,均在40%以上,未见碳青霉烯类耐药菌株,47.5%(508/1 070)的沙门菌同时耐受3类或3类以上抗生素,表现为多重耐药,同时耐受抗生素种类最高为9类。共存在141种耐药谱,优势耐药谱型为NAL、AMP-SAM-NAL-CT和TET。196株CT耐药沙门菌检出1株携带mcr-1基因且超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性的菌株,该菌株为伦敦血清型,是所有测试菌株中唯一1株九重耐药株。部分省份沙门菌耐药率较高。生禽肉和生畜肉来源沙门菌耐药率较高,分别为80.6%(349/433)和73.5%(283/385)。结论我国2015年食源性沙门菌整体耐药水平较高,且多重耐药情况严重,生禽畜肉是耐药沙门菌的主要来源,我国食源性沙门菌中存在携带mcr-1基因的严重耐药菌株,应引起关注。
关键词: 沙门菌; 耐药性; 多重耐药; 硫酸粘菌素; mcr-1; 食源性致病菌; 中国大陆
文章编号:1004-8456(2017)06-0647-06     中图分类号:R155     文献标志码:A    
Resistance analysis of 1 070 Salmonella strains isolated from food sample  in mainland China, 2015
     HU Yu-jie1, WANG Wei1, YAN Shao-fei1, GAN Xin1, LYU Han-yang1, LIU Chang2,       YANG Da-jin1, LI Feng-qin1, XU Jin&
(1.Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Health,China National Center for Food     Safety Risk Assessment,Beijing 100021,China; 2.Food Science and Engineering College,     Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China)
Abstract:ObjectiveTo understand the antimicrobial resistance of foodborne Salmonella isolates in China in 2015, and to obtain the prevalence of mcr-1 gene in colistin(CT)resistant isolates. MethodsBroth microdilution method was used for antimicrobial susceptibility test of 1 070 Salmonella strains against 16 antimicrobial compounds which belonged to 10 categories, and 196 colistin resistant strains were detected for the existence of mcr-1 gene by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(PCR). ResultsAbout 71.9% (769/1 070) of the isolates showed different antimicrobial resistant levels to 16 antimicrobials, and the resistance rates to nalidixic acid(NAL), tetracycline(TET), ampicillin(AMP) and ampicillin-sulbactam(SAM) were as high as above 40%, while all strains were susceptible to carbapenems. 47.5% (508/1 070) of them were identified as multi-drug resistant (MDR) strains and were resistant to as much as nine classes of antimicrobials. There were 141 antimicrobial resistance spectrums with NAL, AMP-SAM-NAL-CT and TET as the top three spectrums. One strain of mcr-1 gene and ESBLs positive which was identified as Salmonella enterica subsp. enterica ser. London had been detected in 196 colistin resistant isolates and it was the only one strain with resistance against nice categories of antimicrobials. Serious multi-drug resistance was found in some provinces and strains recovered from raw poultry meat were detected to be the worst with resistant rate of 80.6%(349/433), followed by isolates from raw livestock meat (73.5%, 283/385). ConclusionAn overall high level antimicrobial resistance was found among foodborne Salmonella isolates in China in 2015, so was the MDR condition, especially for strains recovered from some provinces and from raw poultry and livestock meat. Mcr-1 gene could be carried in foodborne Salmonella isolates recovered from China, therefore, close attention should be paid to its surveillance.
Key words: Salmonella; antimicrobial resistance; multi-drug resistant; colistin; mcr-1; foodborne pathogens; Chinese mainland
沙门菌是常见的食源性致病菌,可引起胃肠炎等疾病,动物源性食品尤其是生禽畜类制品是导致人类感染沙门菌的主要食品之一[1]。在动物养殖过程中广泛使用抗生素易导致或加剧沙门菌的耐药化趋势,养殖、屠宰加工、储藏、运输、销售等不同环节中存在的沙门菌交叉污染及其在食物链中的传播为耐药菌株传递耐药性提供了重要渠道,同时也对公共卫生构成了潜在威胁,因此对我国食源性沙门菌进行耐药性监测十分必要。我国监测数据[2]表明,耐受3类及3类以上抗生素的多重耐药(multi-drug resistance,MDR)沙门菌株比例从20世纪90年代的30%增至本世纪初的70%,美国国家抗生素耐药性监测系统(NARMS)的监测数据[3]也表明,沙门菌对三代头孢类抗生素耐药性从2002年的10%上升至2011年的33.5%,对氨苄青霉素耐药性从16.7%上升到40.5%。细菌耐药性上升趋势给临床治疗和抗生素研发带来了巨大压力,针对世界范围内的“后抗生素时代”威胁[4],世界卫生组织(WHO)已于2015年启动全球抗生素药物耐药性全球行动计划。
        mcr-1基因是国际上首次在动物源性大肠埃希菌中发现的质粒介导粘菌素耐药基因,可介导肠杆菌科细菌对粘菌素类药物产生耐药,并可通过可接合性质粒在不同菌种间传播,介导低水平的粘菌素耐药[5]。相对于以往染色体突变介导粘菌素耐药和不能水平转移的特性[6],此耐药机制的存在加速了该类药物临床耐药性的产生和传递。
        本研究针对2015年国家食品污染和有害因素风险监测网中的沙门菌分离株进行抗生素药物敏感性测定,并对硫酸粘菌素(CT)耐药菌株进行mcr-1基因检测,分析我国2015年食源性沙门菌的耐药性特征,为控制和减少食源性沙门菌耐药性传播提供依据。
1材料与方法
 1.1材料
1.1.1菌株来源
        本研究所用1 070株沙门菌分离自2015年国家食品污染和有害因素风险监测网采集的食品样品,样品种类为生畜肉、生禽肉、蛋制品、动物性海产品、淡水动物产品及其他(蛋糕、面包、沙拉、水果、蔬菜、调味品及米面制品等)。全部菌株来自全国23个省、直辖市和自治区,所有菌株均已生化鉴定复核确认为沙门菌属。药敏质控标准菌株为本实验室保存的大肠埃希菌(ATCC 25922)。
 1.1.2主要仪器与试剂
        荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪(美国Bio-Rad),DensiCHEK Plus比浊仪、Vitek2 Compact生化鉴定仪均购自法国Biomerieux,Luminex 200液相悬浮芯片系统(美国Luminex),生物安全柜,恒温培养箱,台式离心机。
        脑心浸液琼脂(BHA,北京陆桥技术股份有限公司),脑心浸液肉汤(BHI)、MH肉汤均购自英国OXOID,PCR MasterMix、100 bp DNA Ladder均购自天根生化科技(北京)有限公司,沙门菌SSA血清分型试剂盒(美国Luminex)。抗生素药敏板均购自上海复星佰珞生物技术有限公司,包括萘啶酸(NAL)、环丙沙星(CIP)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、四环素(TET)、氯霉素(CHL)、氟苯尼考(FFC)、复方新诺明(SXT)、头孢噻肟(CTX)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻吩(KF)、庆大霉素(GEN)、亚胺培南(IPM)、美罗培南(MEM)、CT。用于mcr-1基因实时定量荧光PCR检测用引物及探针由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所李娟研究员提供。
 1.2方法
1.2.1微量肉汤稀释法抗生素敏感性测试
        使用一次性无菌接种环,将复核鉴定后入库保存的菌株,从40%BHI-甘油冻存管中取出一环划线接种于BHA平板37 ℃过夜培养复苏,挑取单颗菌落再次划线转接BHA平板37 ℃过夜培养纯化。挑取新鲜菌落至3 ml生理盐水,用经过校准的比浊仪调整菌液浊度至0.5麦氏单位浊度,取上述菌悬液60 μl至含有12 ml改良稀释肉汤的无菌加样槽中,充分混匀后按照100 μl/孔加至药敏板中,置于恒温恒湿培养箱内37 ℃孵育18~24 h后,肉眼观察读取每种抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),以大肠埃希菌(ATCC 25922)菌株为质控菌株,依据美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2016年抗生素敏感性测试操作标准[7]质控范围判断药敏板上抗生素质量,结合肠杆菌科耐药判定标准对药敏结果进行判断。FFC质控范围和耐药判定标准参照CLSI动物源性细菌药敏操作标准[8],CT耐药判定标准参照欧洲抗菌药物敏感试验委员会(EUCAST)推荐的临界值(MIC>2 μg/ml为耐药)[9]
1.2.2CT耐药菌株mcr-1基因检测
        选取CT耐药菌株,水煮法提取细菌基因组DNA,实时定量荧光PCR检测mcr-1基因,扩增方法和条件参照文献[10]。阳性对照样品为本实验室保存的2014年国家食品污染和有害因素风险监测网的沙门菌分离株,经全基因组测序确认含有mcr-1基因。
1.2.3超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)检测和血清学鉴定
        针对mcr-1阳性菌株,使用AST-GN14药敏卡在Vitek2 Compact平台检测ESBLs,并核对其他包含抗生素的药敏结果。通过基于Luminex 200平台的液相悬浮芯片系统,使用沙门菌血清分型试剂盒检测沙门菌血清抗原信息,并按照GB 4789.4—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》[11]中规定的沙门菌血清学鉴定程序进行O抗原和H抗原的复核,对照国际通用沙门菌抗原决定式表解(WKLM表)[12],判断菌株血清型别。
2结果
2.1沙门菌分离株对16种抗生素的耐药结果
        1 070株沙门菌中有769株(71.9%)为耐药菌株,对受试的16种抗生素呈现不同程度的耐药,其中对NAL、TET、AMP、SAM的耐药率较高,均在40%以上,分别为52.6%(563/1 070)、44.6%(477/1 070)、41.2%(441/1 070)和40.7%(436/1 070),其次为CHL、SXT、FFC、CT、CIP和GEN,耐药率在11.8%~25.2%之间,4种头孢类抗生素的耐药率均在10%以下。CIP、CHL、KF和FFC的中介率超过8%,分别为39.7%(425/1 070)、13.0%(139/1 070)、9.3%(100/1 070)和8.6%(92/1 070)。2种碳青霉烯类抗生素IPM和MEM均未检测到耐药菌株。耐药结果见表1。
2.2耐药谱分布情况
        多重耐药菌株共有508株,占所有耐药菌株的66.1%(508/769)。耐受1类抗生素即单重耐药的菌株数量最多(15.0%,160/1 070),其次为同时耐受4类抗生素的菌株(13.6%,145/1 070)。769株耐药沙门菌共有141种耐药谱,单重耐药沙门菌中优势耐药谱为NAL(89株),多重耐药沙门菌中优势耐药谱为AMP-SAM-NAL-CT(74株)。检出1株
    表11 070株沙门菌对16种抗生素敏感性测试结果
        Table 1Antimicrobial susceptibility testing results for 1 070 Salmonella strains against 16 antimicrobials   
九重耐药沙门菌,该菌株分离自生猪肉样品,可同时耐受除碳青霉烯类以外的9类抗生素,经鉴定该菌株为伦敦血清型沙门菌(Salmonella enterica subsp. enterica ser. London),血清式为3,10∶1,v∶1,6。对该菌株进行Vitek2药敏卡补充检测,结果提示该菌呈ESBLs阳性,且对单环β-内酰胺类抗生素氨曲南显示耐药。受试的沙门菌耐受抗生素种类和主要耐药谱情况分别见表2和3。
     表2沙门菌耐受抗生素种类及所占比例(n=1 070)
         Table 2Different categories of antimicrobial resistance that Salmonella isolates demonstrated 
         注:耐药种类(0~10)表示沙门菌分离株同时耐受所测试10类抗生素中的种类数 
2.3mcr-1基因检测结果
        荧光定量PCR检测结果表明,196株CT耐药沙门菌分离株中,只有1株检出携带mcr-1基因,且该菌株同时为耐药检测中检出的唯一一株九重耐药株。荧光定量PCR检测结果见图1。
2.4不同地区和食品来源沙门菌分离株耐药结果
        23个省、直辖市和自治区的沙门菌分离株中,
         表3沙门菌主要耐药谱分布情况
        Table 3Dominant antimicrobial resistance spectrums of Salmonella isolates 
         注:表中只列出菌株数为10株及以上的菌株耐药谱,剩余122种耐药谱(含237株)未列出   
       图1荧光定量PCR法检测CT耐药沙门菌分离株mcr-1基因分布
           Figure 1Distribution of mcr-1 gene in colistin resistant Salmonella isolates by real-time fluorescent quantitative PCR detection    
共有19个地区的菌株耐药率高于50%,其中甘肃省、河南省、北京市和黑龙江省4个地区的耐药率均超过80%。8个地区的多重耐药率不低于50%,其中甘肃省多重耐药率超过70%。甘肃省和河南省的七重及以上耐药比例超过25%。详见表4。
从食品样品来源的类别看,生禽肉和生畜肉中检出的沙门菌菌株数占所有测试菌株的76.4%(818/1 070),生禽肉中沙门菌分离株的耐药率最高(80.6%,349/433),其次为生畜肉、蛋与蛋制品、动物性海产品和动物性淡水产品中的沙门菌分离株,耐药率分别为73.5%(283/385)、68.0%(34/50)、58.1%(25/43)和46.7%(49/105);糕点及米面制品、沙拉、蔬果、凉拌菜、调味品等其他食品的耐药率为53.7%(29/54)。详见表5。 
      表4不同地区来源沙门菌分离株耐药状况
          Table 4Antimicrobial resistance of Salmonella isolates recovered from different provinces
          注:—表示无此数据,因部分地区分离菌株数目少于20株,不参与耐药率评价,结果统计在“其他”中,耐药、多重耐药和七重及以上耐药的菌株数分别为25、15和3株  
           表5分离沙门菌在不同食品样品中对所测试10类抗生素耐药分布
           Table 5Antimicrobial resistance distribution against ten categories of antibiotics for Salmonella isolates recovered from different kind of food sample 
           注:R1~R10为菌株耐受抗生素的种类数;其他样品种类包括糕点及米面制品、沙拉、蔬果、酱卤、凉拌菜、调味品   
3讨论
        本研究结果显示,2015年国家食品污染和有害因素风险监测网中分离的食源性沙门菌,对NAL、TET、AMP、SAM这4种抗生素的耐受性较高,耐药率为40.7%~52.6%,提示这几种抗生素可能在养殖环节长期、大量使用。头孢类抗生素的耐药水平较低,但KF和CAZ这2种抗生素出现一定程度的中介菌株,需加强注意并继续保持监测。所有测试菌株中未发现对IPM和MEM耐药菌株,提示碳青霉烯类抗生素仍可作为临床治疗沙门菌感染的终极药物。国际上作为兽用抗生素的CT和FFC,本研究中也呈现出一定的耐药水平,耐药率分别为18.3%(196/1 070)和22.2%(238/1 070),后者还存在8.6%(92/1 070)的中介菌株。受试菌株中存在可同时耐受9类抗生素的沙门菌,表现出严重耐药性。同时从所有菌株来看,耐药谱种类达141种,呈现较高的多态性。本研究结果显示,我国2015年食源性沙门菌分离株的耐药性存在一定程度的地域性差异,部分省份分离株的耐药率、多重耐药率相对于其他省份均处于较高水平,耐药程度较为严重。食品样品来源的差别也影响沙门菌分离株的耐药性,生禽肉和生畜肉样品中沙门菌分离株的耐药性较高,且生畜肉样品中分离株到1株九重耐药株,相关地区和食品种类的抗生素耐药监管需要加强力度。
        氟喹诺酮类和头孢类抗生素是目前临床治疗沙门菌病的一线药物,在我国使用最早和最为广泛的是喹诺酮类抗生素NAL,相较美国1995年批准该药用于畜牧业,我国早在20世纪80年代就批准其作为兽药广泛应用于畜牧养殖业[2],从本研究中食源性沙门菌分离株对NAL的耐药率也提示了抗菌药物的选择压力是导致细菌产生耐药性的主要原因。
        本研究中CIP的中介率(39.7%)较高,一方面由于本研究的判定标准是依照2016年版CLSI进行折点判断,相较于2011年及以前版本CLSI中所有沙门菌属针对CIP的耐药、中介及敏感判断折点(耐药:≥4 μg/ml;中介:2 μg/ml;敏感:≤1 μg/ml),2012年版[13]CLSI中增加了CIP对伤寒沙门菌及肠道外沙门菌的判断折点标准(耐药:≥1 μg/ml;中介:0.12~0.5 μg/ml;敏感:≤0.06 μg/ml),而从2013年版CLSI起,CIP对所有沙门菌属所使用的折点判定标准均调整为2012年版伤寒沙门菌及肠道外沙门菌的折点标准,即相较以前不仅大幅降低了折点临界值,同时扩大了中介折点的判定范围,这也是本研究中CIP中介率较高的一个原因;另一方面也说明2013年以前沙门菌对CIP的耐药水平在国际范围内呈持续上升趋势,因此针对CIP或氟喹诺酮类药物的耐药监测需要持续进行且在相关耐药机理和传播机制方面需要进行深入研究。
        最新研究[14]表明mcr-1基因已通过Incl2、Incx4和IncHl2等流行性质粒以及可移动元件,在全球35个不同国家和地区的人、动物和环境源多种肠杆菌中广泛传播。国外已在禽畜源的沙门菌分离株中检测到该基因[15-16]。本研究中发现的1株生畜肉样品来源的ESBLs阳性伦敦血清型沙门菌,是196株对CT耐药沙门菌中唯一携带mcr-1基因的菌株。值得注意的是,据报道[17-18]该血清型沙门菌可引起食物中毒,表明携带mcr-1基因的沙门菌可通过食物链感染人体。虽然从本研究结果看,该菌株可被碳青霉烯类抗生素抑制,但鉴于mcr-1基因可通过质粒、可移动元件等在肠杆菌科中不同细菌、不同来源菌株中传递和转移,导致耐药基因扩散,对肠道其他菌群间耐药传递的潜在风险不可忽视,同时增加了临床上使用多粘菌素类药物治疗肠杆菌科所引起病症的失效风险,因此畜牧生产及加工过程中抗生素尤其是多粘菌素的使用监管亟待加强。
        通过对我国2015年食源性沙门菌分离株进行耐药性分析,表明我国2015年食源性沙门菌的整体耐药水平较高,且存在携带mcr-1基因的耐药菌株,有必要对食源性沙门菌开展持续监测,针对重要耐药机制、传播机制开展深入研究,以阐明和评估可能的传播方式和疾病风险,保障食品安全。
参考文献
[1]胡豫杰,王晔茹,李凤琴. 北京部分市售整鸡中沙门菌和弯曲菌协同定量污染研究[J].卫生研究,2015,44(1):68-72.
[2]郭云昌,刘秀梅. 市售鸡肉中沙门菌分离株多重耐药谱测定[J]. 中国食品卫生杂志,2005,17(2):100-103.
[3]Centers for Disease Control and Prevention(CDC). National Antimicrobial Resistance Monitoring System for Enteric Bacteria (NARMS): human isolates final report, 2011[R]. Atlanta, Georgia: U.S. Department of Health and Human Services, 2013.
[4]World Health Organization. Global action plan on antimicrobial resistance[R]. Geneva: WHO, 2015.
[5]LIU Y Y, WANG Y, WALSH T R, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study[J]. Lancet Infect Dis, 2016, 16(2): 161-168.
[6]NATION R L,LI J. Colistin in the 21st century[J]. Curr Opin Infect Dis, 2009, 22(6): 535-543.
[7]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). M100-S26 performance standards for antimicrobial susceptibility testing twenty-second informational supplement [M].Wayne:CLSI,2016.
[8]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). VET01S performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility tests for bacteria isolated from animals [M]. Wayne:CLSI,2016.
[9]European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters[EB/OL].(2017-03-13)[2017-08-08]. http://www.creader.com/news/20011219/200112190019.html.
[10]CHEN X, ZHAO X F, CHE J,et al. Detection and dissemination of the colistin resistance gene, mcr-1, from isolates and faecal samples in China[J]. J Med Microbiol, 2017, 66(2):119-125.
[11]中华人民共和国卫生部. 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验:GB 4789.4—2010[S].北京:中国标准出版社,2010. 
[12]PATRICK A D G, FRANCOIS-XAVIER W. Antigenic formulae of the Salmonella serovars[M].9th edtion. Paris:WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur,2007.
[13]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI). M100-S22 performance standards for antimicrobial susceptibility testing,twenty-second informational supplement [M]. Wayne:CLSI,2012.
[14]易灵娴,刘艺云,吴仁杰,等. 质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1研究进展[J].遗传,2017,39(2):110-126.
[15]QUESADA A, UGARTE-RUIZ M, IGLESIAS M R,et al. Detection of plasmid mediated colistin resistance (MCR-1) in Escherichia coli and Salmonella enterica isolated from poultry and swine in Spain[J]. Res Vet Sci, 2016, 105(2):134-135.
[16]ANJUM M F, DUGGETT N A, ABUOUN M,et al. Colistin resistance in Salmonella and Escherichia coli isolates from a pig farm in Great Britain[J]. J Antimicrob Chemother, 2016, 71(8):2306-2313.
[17]郑悦康,叶志英,刘绮明. 一起伦敦沙门氏菌食物中毒的实验室检验[J]. 北华大学学报(自然科学版),2014,15(3):342-344.
[18]YONG D, LIM Y S, YUM J H,et al. Nosocomial outbreak of pediatric gastroenteritis caused by CTX-M-14-type extended-spectrum beta-lactamase-producing strains of Salmonella enterica serovar London[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(7):3519-3521.