DOi:10.13590/j.cjfh.2017.06.021 
2009—2014年马鞍山市食品中李斯特菌污染状况调查 
汪永禄1,王艳2,陶勇1,王利1,叶长芸2

(1.安徽省马鞍山市疾病预防控制中心,安徽 马鞍山243000; 2.中国疾病预防控制     中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室,北京102206)

收稿日期:2017-09-15

作者简介:汪永禄男副主任检验师研究方向为微生物检验E-mail:mas_wyl@163.com     
通信作者:叶长芸女研究员研究方向为病原生物学E-mail:yechangyun@icdc.cn

基金项目:

摘要:目的了解马鞍山市食品中李斯特菌污染状况。方法2009年1月至2014年12月,对马鞍山市部分餐饮店、超市及零售市场中的12类食品(包括畜肉、禽肉、鱼虾、动物内脏、熟食制品、蔬菜、米面制品、豆制品、禽蛋、果汁、乳制品、冷饮)进行随机抽样,共采集2 372份样品进行李斯特菌分离检测,并对检出的单增李斯特菌进行了毒力基因检测。结果2 372份样品中332份存在李斯特菌,检出率为14.00%,其中畜肉检出率为25.15%(82/326),禽肉为23.98%(82/342),鱼虾为16.20%(104/642),动物内脏为11.66%(26/223),熟食为8.49%(31/365),蔬菜为2.88%(4/139),米面制品为2.20%(2/91),豆制品为1.33%(1/75),各类食品李斯特菌检出率比较,差异有统计学意义(χ2=65.64,P<0.05),禽蛋、果汁、乳制品、冷饮中未检出李斯特菌。2009年李斯特菌的检出率最高(23.97%,70/292),其次分别为2011年(15.62%,67/429),2012年(15.36%,49/319),2014年(11.65%,48/412),2013年(11.11%,47/423),2010年(10.26%,51/497),各年度食品中李斯特菌检出率比较差异有统计学意义(χ2=26.80,P<0.05)。对检出的48株单增李斯特菌进行6个毒力基因(hly、prfA、plcB、inlA、actA和iap)的聚合酶链式反应(PCR)检测,结果显示所有分离菌株均具有6个毒力基因。结论马鞍山市食品存在不同程度的李斯特菌污染,具有食源性李斯特菌感染疾病暴发的潜在风险,应加强监督监测,预防李斯特菌所引起的食源性疾病发生。
关键词: 李斯特菌; 污染状况; 毒力基因; PCR; 食源性致病菌; 食品污染物; 食品安全
文章编号:1004-8456(2017)06-0740-05     中图分类号:R155     文献标志码:A    
The investigation of Listeria species in food products in Maanshan during 2009 to 2014
WANG Yong-lu1, WANG Yan2, TAO Yong1, WANG Li1, YE Chang-yun2     
(1.Maanshan Center for Disease Control and Prevention,Anhui Maanshan 243000,China;      2.State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for     Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Dise)
Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to determine the prevalence of Listeria species in food products in Maanshan, Anhui Province. MethodsFrom January 2009 to December 2014, a total of 2 372 food products, including meat, poultry, fishes, shrimps, animal viscera, cooked food, vegetables, flour products, bean products, eggs, juice, dairy products and ice creams, were randomly collected from restaurants, supermarkets and retail markets in Maanshan. Listeria spp. strains were isolated according to GB 4789.30-2010 method. Furthermore, all the Listeria monocytogenes were examined for the presence of virulence genes. ResultsOut of 2 372 tested samples, 332 (14.00%) were contaminated with Listeria spp., of which 25.15% (82/326) were isolated from meats, 23.98% (82/342) from poultry meats, 16.20% (104/642) from fishes and shrimps, 11.66% (26/223) from animal viscera, 8.49% (31/365) from cooked food, 2.88% (4/139) from vegetables, 2.20% (2/91) from flour products and 1.33% (1/75) from bean products. There was no Listeria spp. isolated in eggs, juice, dairy products and ice creams. The highest prevalence of Listeria spp. occurred in 2009 (23.97%, 70/292), followed by 2011 (15.62%, 67/429), 2012 (15.36%, 49/319), 2014 (11.65%, 48/412), 2013 (11.11%, 47/423) and 2010 (10.26%, 51/497). The difference of the prevalence rates of Listeria for different years were statistically significant (χ2=26.80, P<0.05). Six virulence genes, including hly, prfA, plcB, inlA, actA and iap, were observed in all of the L.monocytogenes isolates. ConclusionThere were different contamination levels of Listeria in different food and years in Maanshan. This study revealed the potential risk of foodborne disease outbreak caused by L.monocytogenes. Persistent surveillance on the contamination of Listeria spp. in food products should be strengthened to prevent foodborne listeriosis.
Key words: Listeria; contamination status; virulence genes; PCR; foodborne pathogen; food contamination; food safety
李斯特菌(Listeria)在自然界广泛存在,对多种食品均有不同程度的污染,与其他致病菌比较,其具有独特的生物学特性,可以在不同条件下生长。该菌引起的临床症状包括胃肠症状、发热症状,以及脑膜炎、脑脊髓炎和肿块的形成[1]。随着社会快速发展,由微生物危害导致的食源性疾病不断增加,为了解马鞍山市市售食品中李斯特菌的污染情况,对其进行了调查分析,以评估食源性李斯特菌病发生的风险。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1采样原则
        马鞍山市属于江南水乡,有众多大小不等的水产养殖基地、家禽家畜养殖场等,产品除销售到本地城区外,还销往周边城市,为了避免偏倚,采样时按照产品的生产规模确定采样量,采集有代表性的样品,每种类别的样品采样点分布到市辖所属的3区3县,每个区(县)分别选择2个农贸市场、2个综合超市、3~4个水产养殖基地和家禽家畜养殖场、2家宾馆饭店采集食品。散装食品采样量要求为500 g(ml),定型包装食品采集同一批号,采样量要求为不得少于1 000 g(ml)。
1.1.2样品来源
        2009年1月—2014年12月每季度对马鞍山市采集监测点内的农贸市场、超市、宾馆饭店、养殖场基地等进行采样,共采集鱼虾642份、熟食制品(熟肉、凉拌菜)365份、禽肉342份、畜肉326份、动物内脏223份、蔬菜139份、米面制品91份、豆制品75份、禽蛋49份、果汁47份、冷饮41份和乳制品32份,共计2 372份。所有样品由专业人员按照无菌要求采样,无菌包装。样品采集后于4 ℃保存,8 h内送达实验室检测。
1.1.3主要仪器与试剂
        萘啶酮酸、吖啶黄素、李氏增菌肉汤LB(LB1、LB2)、脑心浸液、PALCAM琼脂、三糖铁琼脂、SIM琼脂均购自北京陆桥技术有限责任公司,科玛嘉李斯特显色培养基(英国Oxoid),GPI鉴定卡及API李斯特菌生化试剂条均购自法国梅里埃,脱氧核糖核酸(DNA)提取试剂盒(北京天为时代科技有限公司),聚合酶链反应(PCR)试剂盒(大连宝生物有限公司),琼脂糖(上海普洛麦格生物制品有限公司)。所有试剂均在有效期内,并定期做培养基质量控制。
1.2方法
1.2.1李斯特菌分离与鉴定
        参照GB 4789.30—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》[2]进行分离检测。对可疑菌落转种三糖铁琼脂斜面37 ℃培养24 h后,对底层斜面均产酸、不产气的菌株做触酶试验,阳性菌以VITEK-32和API李斯特菌生化检测试剂条进行李斯特菌种的鉴定。同时,将菌体接种到SIM,观察H2S产生情况。
1.2.2DNA模板的提取及毒力因子检测
        单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)均接种于脑心肉汤增菌液,37 ℃过夜培养。培养物用DNA提取试剂盒按操作说明进行染色体DNA的提取,然后进行毒力基因的PCR扩增。PCR反应体系中含10×缓冲液(含Mg2+)2 μl、上下游引物(10 mmol/L)各1 μl、dNTPs(10 mmol/L)1 μl,Taq酶0.25 U及模板DNA,用无菌水补足至20 μl。PCR反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,56 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸1 min,30次循环;72 ℃延伸10 min(prfA的退火温度为52 ℃)。将扩增产物加入含EB的1.0%琼脂糖凝胶进行电泳后检测。引物序列见表1,由上海生物工程技术有限公司合成。
    表1单增李斯特菌毒力因子检测引物
        Table 1Primers used for the detection of virulence genes in L.monocytogenes  
1.3统计学分析
        利用Excel建立数据库,应用SPSS 17.0软件进行统计分析,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1李斯特菌检出情况
        12类2 372份食品样品中,有332份样品检出李斯特菌,其中检出单增李斯特菌48株(2.02%);检出英诺克李斯特菌(Listeria innocua)268株(11.30%);检出韦氏李斯特菌(Listeria welshimeri)10株(0.42%);检出格氏李斯特菌(Listeria grayi)5株(0.21%);检出塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)1株(0.04%);未检出其他种的李斯特菌。332份阳性样品均为每份样品中只检出一种李斯特菌,没有同一份样品检出2种及以上的李斯特菌。
2.2不同食品中李斯特菌的检出情况
        在12类食品样品中,以畜肉类中李斯特菌检出率最高(25.15%,82/326);其次为禽肉、鱼虾、动物内脏、熟食、蔬菜、米面制品和豆制品,分别为23.98%(82/342)、16.20%(104/642)、11.66%(26/223)、8.49%(31/365)、2.88%(4/139)、2.20%(2/91)和1.33%(1/75),检出率差异有统计学意义(χ2=65.64,P<0.05)。而在禽蛋、果汁、乳制品、冷饮等4类食品中,未检出李斯特菌。其中禽肉和畜肉中单增李斯特菌的检出率高于其他食品种类,分别为4.39%(15/342)和3.99%(13/326),见表2。 
    表2各类食品中李斯特菌和单增李斯特菌的检出情况
        Table 2Isolation of Listeria spp. and L.monocytogenes in different food products    
2.3不同种类食品中李斯特菌的时间分布情况
        不同种类食品在不同年份的李斯特菌的检出率有所不同,畜肉、禽肉和鱼虾在4个年份(2009、2010、2013、2014年)中均为李斯特菌阳性的前3位食品,其中畜肉在6个年份中均为李斯特菌阳性的前3位食品之一。熟食在2009、2011、2012年份中李斯特菌的检出率也相对较高。不同食品在不同年份的李斯特菌检出情况见表3。
    表32009—2014年马鞍山市不同种类食品中李斯特菌检测情况(%)
        Table 3Prevalence of Listeria spp. in different food products in Maanshan during 2009 to 2014
        注:—表示未采集样品    
2.448株单增李斯特菌的6个毒力基因检测结果
        对48株单增李斯特菌分离株进行6个毒力基因(hly、prfA、plcB、inlA、actA和iap)的PCR扩增,结果均为阳性,提示这48株单增李斯特菌分离菌株具有致病特性,见图1。
     注:M:DNA相对分子量标准(DL2000);1:hly扩增产物;2:prfA扩增产物;3:plcB扩增产物;4:actA扩增产物;5:inlA扩增产物;6:iap扩增产物
         图16个毒力基因的PCR产物
         Figure 1Products of PCR for six virulence genes
    3讨论
        李斯特菌是广泛分布于自然界的重要人畜共患病病原菌。近年来,李斯特菌病已成为全球性的食源性疾病而在国际上引起高度重视。早在20世纪90年代单增李斯特菌就被世界卫生组织(WHO)列为食品中4大食源性致病菌之一,并作为食源性致病菌重点监测对象之一[3]。本次调查结果显示,12类2 372份食品中,检出李斯特菌阳性的为332份,鱼虾、畜肉、禽肉、熟食、动物内脏、蔬菜、米面制品和豆制品等8类食品中均有检出。本研究共检测到4种李斯特菌,按检出率的高低依次分别为英诺克李斯特菌(11.30%)、单增李斯特菌(2.02%)、韦氏李斯特菌(0.42%)、格氏李斯特菌(0.21%)和塞氏李斯特菌(0.04%),与张秀丽等[4]报道的对河南省713份食品李斯特菌的检出情况相似。通过监测发现,马鞍山地区食品中存在不同程度的李斯特菌污染,生肉(畜肉和禽肉)和动物性水产品(鱼虾等)是主要的污染食品,在2009、2010、2013、2014年均为李斯特菌污染率排前3位的食品。提示生肉制品和动物性水产品在加工、贮存、销售过程中易受到李斯特菌污染。同时由于李斯特菌对不良环境具有较强的耐受性,可在4 ℃生长繁殖,具有嗜冷特性,可在pH=5~8条件下生长,能耐受10%的高盐浓度环境[5],应对其在食品中的污染引起重视。
        当前,随着人们生活习惯的改变,熟食制品的消费越来越多,尤其是夏秋高温季节。李斯特菌最适生长温度为30~37 ℃,加之夏秋季节人体肠道的防御功能有所下降,对李斯特菌的易感性增强。本次调查的365份熟食中,31份检出李斯特菌,检出率为8.49%,而单增李斯特菌的阳性分离率达到2.19%(8/365),且均携带重要的毒力基因,具有致病特性。提示在熟食烹饪、储藏和销售环节中存在单增李斯特菌的污染,可能与生熟用具不分、缺乏有效的管理措施有关,因此,有关部门应加强熟食制品的原料来源、加工、储藏和销售环节的卫生监管,防止交叉污染和食源性李斯特菌病的发生。
        李斯特菌属现报道分为17个种,其中常见的菌种包括单增李斯特菌、伊氏李斯特菌(L.ivanovii,又称绵羊李斯特菌)、英诺克李斯特菌(又称无害李斯特菌)、韦氏李斯特菌、塞氏李斯特菌、格氏李斯特菌。目前,除单增李斯特菌和伊氏李斯特菌外,其他4种李斯特菌被认为没有致病性,极少有引起食源性疾病的报道。但是,有报道英诺克李斯特菌、塞氏李斯特菌和格氏李斯特菌可引起人严重的菌血症、化脓性脑膜炎和眼结膜炎,而且英诺克李斯特菌常伴随单增李斯特菌出现,被视为后者的指示菌[6]。这提示除单增李斯特菌外,其他菌种的李斯特菌也可能对人群健康存在潜在威胁。本次调查英诺克李斯特菌在食品中的污染率达11.30%,说明马鞍山地区食品中污染李斯特菌的情况较为普遍,有关部门应加强对食品生产、存储、运输及销售等各个环节的卫生监督,减少食品污染机会,从而降低人群感染李斯特菌的风险。
        单增李斯特菌是引起动物和人类疾病的重要食源性致病菌,属于胞内寄生菌,能在巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和肝细胞内增殖。通过检测单增李斯特菌的毒力基因,可以了解这些基因在食品中单增李斯特菌的污染情况,为预防食源性疾病暴发提供科学的指导依据。hly基因是单增李斯特菌重要的毒力基因,其编码的毒力因子LLO是一种穿孔毒素,可溶解大多数哺乳动物的红细胞,破坏吞噬体、抑制巨噬细胞递呈抗原、促进菌体进入细胞,是细菌得以在胞液内增殖的先决条件,该基因的缺失将导致细菌毒力的全部丧失[5]。prfA是一个调控基因,对多个毒力基因表达进行正向调控,它的缺失将直接使单增李斯特菌的毒力缺失[7];plcB产生磷脂酰胆碱磷脂酶,帮助细菌在宿主细胞间扩散[8];inlA是内化素家族的成员,它与单增李斯特菌的侵袭力有关[9];actA表达肌动蛋白聚集蛋白,是单增李斯特菌的动力来源,它的缺失将使单增李斯特菌失去动力[10]iap产生P60蛋白,是单增李斯特菌的重要抗原,与单增李斯特菌的毒力密切相关[11]。本次调查从禽肉、畜肉、熟食、鱼虾、动物内脏中分离到的48株单增李斯特菌均携带hly、prfA、plcB、inlA、actA和iap六个重要的毒力因子,提示其具有致病特性,可引起食源性疾病的发生。
        本次持续6年的调查发现,马鞍山地区食品中李斯特菌的污染范围较广,并检出致病性的单增李斯特菌,具有导致马鞍山地区居民发生食源性李斯特菌病的风险,以及潜在的感染暴发的可能性,应引起相关部门的高度重视,加强食品中的病原学监测和风险因素控制。
参考文献
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