韩小敏,韩春卉,李凤琴.4种交链孢毒素对人食管上皮细胞Het-1 A的体外毒性研究[J].中国食品卫生杂志,2018,30(1):1-5.DOi:10.13590/j.cjfh.2018.01.002
COI及cytb基因对河鲀鱼鱼种鉴定的适用性研究
(国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京 100021)
收稿日期：2017-12-06
作者简介：李楠 女 副研究员 研究方向为食品卫生 E-mail:linan100041@cfsa.net.cn
通信作者：江涛 男 研究员 研究方向为食品卫生 E-mail:jiangtao001@cfsa.net.cn
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81470148）
摘要:目的 建立河鲀鱼DNA条形码鉴定方法，探讨细胞色素氧化酶亚基I（COI）及细胞色素b（cytb）基因对我国常见东方鲀属、兔头鲀属河鲀鱼鱼种鉴定的适用性。方法 野捕河鲀鱼经形态学鉴定后，钓取COI及cytb基因序列并测序。从GenBank下载已有河鲀鱼参考序列，分别构建COI及cytb基因分子进化树，确定样品种属并与形态学鉴定比对。应用所建方法对中毒样品进行河鲀成分鉴定。结果 COI和cytb基因分子进化树将57份样品聚类到东方鲀属和兔头鲀属的9个鱼种，除棕斑兔头鲀和暗鳍兔头鲀（COI进化树）、暗纹东方鲀和晕环东方鲀（cytb进化树）外，2种条形码均能对其余鱼种进行有效区分。中毒样品经鉴定均含有月兔头鲀。结论 所建立的DNA条形码方法可有效鉴定河鲀鱼鱼种，弥补形态学鉴定的缺陷。
关键词:
河鲀鱼； COI基因； cytb基因； DNA条形码； 鱼种； 鉴定； 食品安全
文章编号：1004-8456(2018)01-0006-06
中图分类号：R155
文献标志码：A
Application of COI and cytb gene in species identification of pufferfish
(Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Ministry of Health，China National Centerfor Food Safety Risk Assessment，Beijing 100021，China)
Abstract:Objective Develop the identification method for puffer fish species and explorethe applicability of cytochrome oxidase subunit Ⅰ(COI) and cytochrome b(cytb) gene in species identification of Takifugu and Lagocephalus.Methods
COI and cytb sequences of Takifugu and Lagocephalus were amplified and sequenced. Phylogenetic tree was built by MEGA 6.0 to determine the species of puffer fish. Several poisoning samples of roasted fish fillet were tested by the established method.Results Total 57 samples were classified into 9 species. Phylogenetic tree which were built based on COI and cytb gene could effectively distinguish most species except Lagocephalus spadiceus and Lagocephalus gloveri, Takifugu obscures and Takifugu coronoidus respectively. Lagocephalus lunaris were detected from poisoning samples.Conclusion DNA barcode method could effectively identify puffer fish and make up the defects in morphological identification.
Key words:
Puffer fish; COI gene; cytb gene; DNA barcode; fish species; identification; food safety
河鲀鱼自古以来是我国沿海地区的传统美食，但是部分河鲀鱼含有河鲀毒素（tetrodotoxin，TTX），该毒素能够选择性抑制神经和骨骼肌细胞膜的钠离子通道，常规的食品加工方式不会使其降解［1］，因而食用或误食有毒河鲀鱼引起的TTX中毒历来是我国沿海地区食物中毒的主要死因之一。近年来随着食品掺假手段的不断翻新和物流发展，混入河鲀鱼成分的鱼类制品也进入国内市场。据不完全统计，2005—2016年间在我国福建、上海、浙江、山东、江苏等地发生了8起因食用烤鱼片引起的TTX中毒事件，造成14人中毒5人死亡，病死率较高［2］。这种鱼类制品中混入有毒河鲀鱼且行销市场的行为严重危害了消费者的健康和生命，因此对市售鱼类及其制品进行河鲀鱼成分鉴定及TTX含量监测，是预防TTX中毒、保护消费者健康与生命的有效手段，也自然成为河鲀鱼中毒事件中样品溯源的关键技术。
传统的河鲀鱼鱼种鉴定主要依赖于河鲀的外部形态学特征，但面对形态学特征缺失的鱼类制品时，传统形态学鉴定方法的应用几乎完全受到限制，这种情况下为开展食品溯源而进行的河鲀鱼鱼种鉴定方法必须另辟蹊径。DNA条形码通过分析标准化的线粒体DNA片段，能够快速准确的识别物种［3］，这种基于DNA的方法提供了一个强大且标准化的物种识别模式，已被成功地应用于海洋鱼类和淡水鱼类的鉴定［4］，弥补了传统形态学鉴定方法的缺陷，如残余物（鱼片、卵、幼体）的识别［5］，可用于解决传统形态学鉴定方法不能胜任的情况。目前国内外多数研究采用COI基因作为鱼类鉴定的参考基因，也有学者认为如果仅以一种基因序列作为参考基因，有可能导致鉴定结果发生偏差，因此建议同时使用2种基因进行鉴定［6］。在河鲀鱼鱼种鉴定研究领域，倪健波［7］建立了基于cytb基因的荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测技术，对3种兔头鲀进行了分析，其适用的河鲀鱼鱼种有待进一步验证。陈文炳等［8］对3属13种河鲀鱼进行了16S rRNA基因的部分DNA序列同源性分析，探讨了该基因在河鲀鱼种属鉴别中应用的可能性，认为16S rRNA可能存在趋向保守、一定种群内遗传变异较小的问题，因而对部分鱼种无法鉴别到种，建议联合线粒体COI、cytb以及核糖体18S/28S rDNA等基因片段进行序列的组合分析。
本研究基于对河鲀鱼鱼种更精准的鉴定需要，针对我国常见的东方鲀属和兔头鲀属河鲀鱼分别设计了COI及cytb引物，探讨COI及cytb基因对河鲀鱼鱼种鉴定的适用性，目的是为鱼类制品的食用安全和河鲀鱼资源的合法利用提供相应技术支持。
DNA MarkerⅢ、2×TaqPCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）均购自天根生化科技（北京）有限公司，pMD19-T Vector、JM109感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司，DNeasy Blood & Tissue Kit［50次，凯杰生物技术（上海）有限公司］，引物由北京英骏生物技术有限公司合成
参照GenBank上发布的东方鲀属、兔头鲀属河鲀鱼DNA序列，选择位于COI、cytb基因两侧保守性较高的区域，分别设计合成针对兔头鲀属（COI-1，cytb-1）和东方鲀属（COI-2，cytb-2）的扩增引物，如表1所示。PCR反应体系50 μl：2×TaqPCR MasterMix 25 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl，DNA模板11 μl，ddH2O 10 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸8 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收DNA，连接、克隆、转化JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选。每份样品挑选3个白色菌落，摇菌后送北京英骏生物技术有限公司测序。
由图1可见，基于COI基因构建的NJ和ML进化树一致将1～14号样品归属到暗纹东方鲀，15～21号归属到黄鳍东方鲀，22～36号归属到红鳍东方鲀，37～39号归属到密点东方鲀，40～42号归属到紫色东方鲀，54～56号归属到月兔头鲀，上述鱼种聚类的节点支持率在73%～99%。对于44～53号样品，两种进化树均将其与棕斑兔头鲀、暗鳍兔头鲀聚类到一起，节点支持率为97%～99%，无法进一步明确分辨物种。
由图2可见，基于cytb基因构建的NJ和ML进化树对15～42号、54～56号样品的鉴定结果与COI进化树一致，将44～53号归属到棕斑兔头鲀，上述鱼种聚类的节点支持率在98%～100%。对于1～14号样品，两种进化树将其与暗纹东方鲀、晕环东方鲀聚类到一起，节点支持率为99%，无法进一步明确分辨物种。
综上所述，基于两种序列所构建的分子进化树均可明确分辨黄鳍东方鲀、红鳍东方鲀、密点东方鲀、紫色东方鲀和月兔头鲀，符合形态学鉴定结果，见表3。
基于对鱼类及其制品中河鲀鱼成分更精准鉴定的需要，本研究以传统形态学鉴定结论为基础，探讨了COI及cytb基因对于我国常见东方鲀属及兔头鲀属河鲀鱼鱼种鉴定的适用性。构建的COI及cytb分子进化树表明，2种基因条码在对红鳍东方鲀、黄鳍东方鲀、紫色东方鲀、密点东方鲀以及月兔头鲀的鉴定上显示出较好的适用性。对于暗纹东方鲀，基于cytb基因构建的NJ和ML进化树均无法将其与晕环东方鲀区分开，经比对发现GenBank数据库下载的这两种鱼种的cytb基因序列完全相同，对鉴定造成了困扰。而基于COI基因构建的进化树则明确将1～14号样品聚类到暗纹东方鲀，因此对于暗纹东方鲀COI基因是更好的选择。对于棕斑兔头鲀的鉴定，cytb基因则显示出明显的优势，与COI基因比较，cytb基因进化树明确将棕斑兔头鲀与暗鳍兔头鲀区分开，经比对发现这2种鱼种的COI基因仅有2个碱基的差异。由此可见，造成COI基因对棕斑与暗鳍兔头鲀、cytb基因对暗纹与晕环东方鲀无法区分的原因，一方面可能是这4个鱼种的COI或cytb条形码提供的遗传信息有限，两两比较碱基差异小；另一方面可能是引用的参考序列对应的原始物种鉴定不准确，命名错误导致序列信息与物种不对应；因此，COI与cytb基因条码的联合分析能够提高DNA方法对物种的分辨能力。所建立的方法对中毒样品的鉴定结果显示，3份标称为鳕鱼和马面鱼的烤鱼片中均检出剧毒的月兔头鲀成分。月兔头鲀是我国引起中毒的主要鱼种，其肌肉及内脏含有大量的TTX，被加工成烤鱼片后失去原有形态学特征导致无法辨认，因而对消费者身体健康和生命安全具有潜在的威胁。
本研究通过对东方鲀属、兔头鲀属各鱼种进行系统发育分析，确定COI和cytb基因能够对兔头鲀属和东方鲀属进行种级水平的精准鉴定。结合以往对烤鱼片中毒事件的处理经验，建议今后在鱼类制品的食品安全监测、中毒样品的溯源等工作中，应将样品中TTX的含量水平检测与河鲀鱼成分鉴定同时进行。通过TTX检测筛查出具有安全风险的食品、探明中毒原因，通过DNA条形码鉴定确定TTX的带入物种是否为河鲀鱼，这对维护消费者利益、预防河鲀中毒以及合理利用河鲀资源具有重要意义。
传统的河鲀鱼鱼种鉴定主要依赖于河鲀的外部形态学特征，但面对形态学特征缺失的鱼类制品时，传统形态学鉴定方法的应用几乎完全受到限制，这种情况下为开展食品溯源而进行的河鲀鱼鱼种鉴定方法必须另辟蹊径。DNA条形码通过分析标准化的线粒体DNA片段，能够快速准确的识别物种［3］，这种基于DNA的方法提供了一个强大且标准化的物种识别模式，已被成功地应用于海洋鱼类和淡水鱼类的鉴定［4］，弥补了传统形态学鉴定方法的缺陷，如残余物（鱼片、卵、幼体）的识别［5］，可用于解决传统形态学鉴定方法不能胜任的情况。目前国内外多数研究采用COI基因作为鱼类鉴定的参考基因，也有学者认为如果仅以一种基因序列作为参考基因，有可能导致鉴定结果发生偏差，因此建议同时使用2种基因进行鉴定［6］。在河鲀鱼鱼种鉴定研究领域，倪健波［7］建立了基于cytb基因的荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测技术，对3种兔头鲀进行了分析，其适用的河鲀鱼鱼种有待进一步验证。陈文炳等［8］对3属13种河鲀鱼进行了16S rRNA基因的部分DNA序列同源性分析，探讨了该基因在河鲀鱼种属鉴别中应用的可能性，认为16S rRNA可能存在趋向保守、一定种群内遗传变异较小的问题，因而对部分鱼种无法鉴别到种，建议联合线粒体COI、cytb以及核糖体18S/28S rDNA等基因片段进行序列的组合分析。
本研究基于对河鲀鱼鱼种更精准的鉴定需要，针对我国常见的东方鲀属和兔头鲀属河鲀鱼分别设计了COI及cytb引物，探讨COI及cytb基因对河鲀鱼鱼种鉴定的适用性，目的是为鱼类制品的食用安全和河鲀鱼资源的合法利用提供相应技术支持。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品来源
57份野生河鲀鱼样品于2006—2011年间在我国福建省、广东省沿海地区采集，由福建省水产研究所专家对样品进行形态学鉴定并出具报告。3份中毒样品为2010年在南京市引发一名6岁儿童中毒的烤鱼片可疑样品，其中402、409号样品标称为鳕鱼片，414号样品标称为马面鱼，经酶联免疫吸附（ELISA）测定检测均含有TTX。
1.1.2主要仪器与试剂
基因扩增仪（美国MJ Research）、微量可调移液器、电泳仪、恒温混匀仪、成像系统（美国Bio-Rad）、小型高速离心机、涡旋振荡器。DNA MarkerⅢ、2×TaqPCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（普通离心柱型）均购自天根生化科技（北京）有限公司，pMD19-T Vector、JM109感受态细胞均购自宝生物工程（大连）有限公司，DNeasy Blood & Tissue Kit［50次，凯杰生物技术（上海）有限公司］，引物由北京英骏生物技术有限公司合成
1.2方法
1.2.1DNA的提取、扩增及测序
按照DNeasy Blood & Tissue Kit说明书提取DNA。200 μl AE试剂洗脱DNA，-20 ℃保存。参照GenBank上发布的东方鲀属、兔头鲀属河鲀鱼DNA序列，选择位于COI、cytb基因两侧保守性较高的区域，分别设计合成针对兔头鲀属（COI-1，cytb-1）和东方鲀属（COI-2，cytb-2）的扩增引物，如表1所示。PCR反应体系50 μl：2×TaqPCR MasterMix 25 μl，引物（10 μmol/L）各2 μl，DNA模板11 μl，ddH2O 10 μl。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，33个循环；72 ℃延伸8 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收DNA，连接、克隆、转化JM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选。每份样品挑选3个白色菌落，摇菌后送北京英骏生物技术有限公司测序。
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表1COI及cytb引物 Table 1Sequences of primer |
1.2.2数据分析
测序结果用Contig Express软件拼接并纠错后，去掉两端载体序列得到样品的COI及cytb基因序列。将得到的序列与GenBank数据库下载的东方鲀属、兔头鲀属的COI及cytb参考序列进行比较。采用Clustal X软件进行比对，应用MEGA 6.0软件构建基于邻接（NJ）法、最大似然（ML）法的分子进化树，置信度（bootstrap）1 000次循环检查
1.2.3中毒样品鉴定
提取烤鱼片基因组DNA、扩增、克隆和测序，构建分子进化树鉴定鱼种。
2结果与分析
2.1样品的形态学鉴定
经形态学鉴定，57份样品涵盖东方鲀属和兔头鲀属的9个鱼种：暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）、黄鳍东方鲀（Takifugu xanthopterus）、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）、密点东方鲀（Takifugu stictonotus）、紫色东方鲀（Takifugu porphyreus）、棕斑兔头鲀（Lagocephalus spadiceus）、月兔头鲀（Lagocephalus lunaris）、横纹东方鲀（Takifugu oblongus）和黑鳃兔头鲀（Lagocephalus inermis）。
2.2样品COI及cytb基因的扩增和克隆
成功扩增了55条COI序列及57条cytb序列，43号和57号样品的COI基因扩增失败，cytb基因全部扩增成功。
2.3分子进化树分析
从GenBank数据库下载22条COI序列及23条cytb序列作为东方鲀属和兔头鲀属鱼种参考序列（见表2），NJ法、ML法构建COI及cytb基因的分子进化树，如图1、2所示。由图1可见，基于COI基因构建的NJ和ML进化树一致将1～14号样品归属到暗纹东方鲀，15～21号归属到黄鳍东方鲀，22～36号归属到红鳍东方鲀，37～39号归属到密点东方鲀，40～42号归属到紫色东方鲀，54～56号归属到月兔头鲀，上述鱼种聚类的节点支持率在73%～99%。对于44～53号样品，两种进化树均将其与棕斑兔头鲀、暗鳍兔头鲀聚类到一起，节点支持率为97%～99%，无法进一步明确分辨物种。
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表2GenBank参考序列 Table 2Refernce sequences from GenBank |
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图1基于COI基因构建的NJ进化树（左）和ML进化树（右） Figure 1Neighbor-Joining tree and maximum likelihood tree of COI gene |
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图2基于cytb基因构建的NJ进化树(左)和ML进化树（右） Figure 2Neighbor-Joining tree and maximum likelihood tree of cytb gene |
综上所述，基于两种序列所构建的分子进化树均可明确分辨黄鳍东方鲀、红鳍东方鲀、密点东方鲀、紫色东方鲀和月兔头鲀，符合形态学鉴定结果，见表3。
2.4中毒样品的鉴定
基于COI基因构建的中毒样品NJ进化树显示（图3），3份样品均检出月兔头鲀成分。
3讨论
DNA条形码作为一种有效的物种鉴定工具，近年来已广泛应用于科学研究、产品标签、食品欺诈等众多领域。线粒体COI及cytb基因是动物分类中公认最为可靠的基因，二者都具有遗传信息稳定而丰富、进化速率适中的特点。COI基因结构简单、相对保守，覆盖了更广泛的分类单元，已被建议作为动物界物种鉴定的通用条码，在许多鱼种、昆虫和鸟类等动物中均得到了很好的应用验证［9-10］。 cytb基因可自身编码蛋白，在碱基组成上具有偏好性从而形成碱基差异。二者比较，COI基因进化速率较慢，且比cytb基因拥有更多的系统发育信号，在种水平的鉴定上，COI基因通过多种方法构建的进化树得到的结果有较高的一致性；在亚种水平的鉴定上，COI基因作为DNA条形码比cytb基因更为有效，更适合解析亲缘关系密切的类群［11-13］。对于COI基因不能有效鉴定的物种，建议使用cytb基因作为辅助基因进行鉴定［14］。
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表3样品的鱼种鉴定结果 Table 3Species identification of samples |
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图3基于COI基因构建的中毒样品NJ进化树 Figure 3Neighbor-Joining tree of poisoning samples |
本研究通过对东方鲀属、兔头鲀属各鱼种进行系统发育分析，确定COI和cytb基因能够对兔头鲀属和东方鲀属进行种级水平的精准鉴定。结合以往对烤鱼片中毒事件的处理经验，建议今后在鱼类制品的食品安全监测、中毒样品的溯源等工作中，应将样品中TTX的含量水平检测与河鲀鱼成分鉴定同时进行。通过TTX检测筛查出具有安全风险的食品、探明中毒原因，通过DNA条形码鉴定确定TTX的带入物种是否为河鲀鱼，这对维护消费者利益、预防河鲀中毒以及合理利用河鲀资源具有重要意义。
参考文献
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