DOi:10.13590/j.cjfh.2018.01.008
固相萃取-高效液相色谱法测定婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E的含量
黄旭,刘家阳

(辽宁省食品检验检测院,辽宁 沈阳 110015)

收稿日期:2017-11-09

作者简介: 黄旭 男 工程师 研究方向为食品检验      E-mail:41856453@qq.com

基金项目:

摘要:目的 建立固相萃取-高效液相色谱法同时测定婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E的含量。方法 样品经高温皂化反应后,将皂化液通过EXtrelut NT20固相萃取柱,对目标待测物进行净化,洗脱液经氮气吹干复溶后,过滤膜直接进样,以甲醇作为流动相,通过Zorbax C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分离,外标法定量。结果 维生素A标准溶液在0.5~5.0 mg/L范围内,维生素E标准溶液在5.0~50 mg/L范围内均呈现良好的线性关系,相关系数(r2)均≥0.999;样品3个水平加标回收率分别为86.0%~104.6%和89.0%~104.0%,相对标准偏差(RSD)均<3.0%;检出限分别为1.0和10 μg/100 g。结论 该方法可用于婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E的同时检测,操作简单、快速、准确。
关键词: 固相萃取-高效液相色谱; 婴幼儿配方粉; 维生素A; 维生素E; 食品强化剂; 测定
文章编号:1004-8456(2018)01-0038-05     中图分类号:R155      文献标志码:A    
Determination of vitamin A and vitamin E in infant formula powder by solid phase extraction and high performance liquid chromatography
HUANG Xu, LIU Jia-yang
((Liaoning Institute for Food Inspection and Testing,Liaoning Shenyang 110015,China)
Abstract:Objective To establish a method for detection of vitamin A and vitamin E in infant milk powder with high performance liquid chromatography (HPLC) by solid phase extraction.Methods After saponification,the saponified solution was purified by the SPE cartridge, the eluent was collected and applied a nitrogen evaporation. After redissolution, the analytes were detected by HPLC, using methanol as mobile phase, separated by Zorbax C18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) and calculate by the external standard method.Results Vitamin A had a good linear relationship within 0.5-5.0 mg/L and 5.0-50 mg/L for vitamin E, the correlation coefficients of the standard curve of 0.999. The recoveries at three spiked levels were from 86.0%-104.6% and 89.0%-104.0%, and the relative standard deviations (RSD) were less than 3.0%. The limit of detection (LOD) were 1.0 and 10 μg/100 g.Conclusion This method could be applied to the detection of vitamin A and vitamin E in infant milk powder at the same time, and it was simple, fast and accurate.
Key words: Solid phase-high performance liquid chromatography extraction; infant powder; vitamin A; vitamin E; food fortifier; test
 维生素A(vitamin A)又称视黄醇(其醛衍生物视黄醛)或抗干眼病因子,是一个具有脂环的不饱和一元醇,包括动物性食物来源的维生素A1、A2两种,是一类具有视黄醇生物活性的物质。维生素A1多存在于哺乳动物及咸水鱼的肝脏中,而维生素A2常存在于淡水鱼的肝脏中。由于维生素A2的活性比维生素A1低,所以婴幼儿配方粉中所添加的维生素A都是指维生素A1。维生素A具有维持正常视觉功能、维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成功能、促进呼吸系统发育和维持骨骼正常生长发育功能等[1],但其过度摄入可引起头痛、恶心、腹泻、肝脾大等,尤其对于婴幼儿来说,维生素A更需适量摄入。
        维生素E(vitamin E)是一种脂溶性维生素[2],其水解产物为生育酚,是最主要的抗氧化剂之一。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物,其中α-生育酚是自然界中分布最广泛、含量最丰富、活性最高的维生素E形式。婴幼儿配方粉中所添加维生素E也均是α-生育酚。维生素E可以保护T淋巴细胞、保护红细胞、抗自由基氧化、抑制血小板聚集,对婴幼儿的生长发育有很好的功能性作用。但如果长期超剂量应用会有潜在毒性,造成人体出现唇炎、恶心、呕吐、眩晕、视力模糊、胃肠功能紊乱等症状。对于婴幼儿来说,维生素E的摄取也需合理适量。
        两种维生素都是婴幼儿在生长发育过程中必不可少的物质,对婴幼儿的生长发育起着非常重要的作用,但是如果过量服用同样会引起婴幼儿健康的多种问题,因此对于婴幼儿配方粉中添加的两种维生素的使用剂量,必须进行必要的控制,以达到相关标准[3-4]的要求,做好严格的质控。
        目前国家标准[5]中规定的方法是基于皂化后,对皂化液进行液液萃取,合并分次的萃取液经旋转蒸发浓缩后,氮气吹干,复溶,定容,进入液相色谱分析。前处理过程中使用的液液萃取效率较低,两相界面容易出现乳化等现象,不利于皂化液中的目标待测物完全转移到萃取液中,且在萃取液的浓缩过程中,对于见光易分解的目标待测物总量也是一种不小的损失。国标方法前处理操作复杂,且处理过程中使用了分液漏斗以及旋转蒸发等操作步骤,这些操作不利于大批量样品同时进行前处理。相关文献[6-7]也对检验方法进行了改进,但是前处理过程还是基于液液萃取或采用萃取液旋转蒸发浓缩等步骤,依旧无法提高检测速度。本试验方法中样品的提取和净化使用了固相萃取的方式,且对萃取液采用了氮吹的方式进行浓缩,利于试验的大批量操作,提高了检测效率,降低了试验难度。 
1材料与方法    
1.1主要仪器与试剂
        Waters E2695高效液相色谱(包括四元梯度泵和PDA检测器,美国Waters)、分析天平(Mettler-ML204)、Milli-Q超纯水、旋转混合仪、恒温振荡水浴锅、EXtrelut NT20固相萃取柱(德国Merck)。
        维生素A(V-011)、维生素E(90669)标准品均购自美国Sigma,甲醇、乙醇、乙腈、正己烷均为色谱纯,氢氧化钾、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、抗坏血酸、淀粉酶等均为分析纯。     
1.2方法     
1.2.1标准溶液配制
        标准储备液的配制:准确称取适量标准品维生素A、维生素E用无水乙醇溶解使其浓度为1.0 mg/ml,并储存于-20 ℃冰箱中。使用前,先用紫外分光光度计标定储备液的准确浓度。
        混合标准中间液的配制:准确吸取维生素A标准储备溶液1.00 ml和维生素E标准储备溶液10.00 ml于同一100 ml棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,此溶液中维生素A浓度为10.0 mg/L,维生素E浓度为100 mg/L。
        混合标准系列工作溶液的配制:分别准确吸取维生素A和维生素E混合标准中间液0.50、2.00、3.00、4.00、5.00 ml于10 ml棕色容量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,配制成维生素A和维生素E的混合标准系列工作溶液,浓度为维生素A:0.5、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L;维生素E:5.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。     
1.2.2样品前处理   
1.2.2.1皂化过程
        不含淀粉的样品:准确称取均质后的样品10 g(精确至0.01 g)于250 ml棕色碘量瓶中,依次加入20 ml水、1 g抗坏血酸、50 ml无水乙醇、5 g氢氧化钾,充分摇匀,慢慢向瓶底部冲入氮气,将瓶口盖紧密封,放置于恒温水浴锅中,85 ℃水浴边振荡边进行皂化反应30 min。反应完全后,将溶液放置至室温,用水将全部皂化液转移到100 ml容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。(试验过程应尽量避光,且在通风橱中进行。)
        含淀粉的样品:称取均质后的样品10 g(精确至0.01 g)于250 ml棕色碘量瓶中,加入20 ml 40 ℃水混匀,加入0.5 g淀粉酶,放入60 ℃水浴避光恒温振荡30 min,加入1 g抗坏血酸、50 ml无水乙醇、5 g氢氧化钾,充分摇匀,慢慢向瓶底部冲入氮气,将瓶口盖紧密封,放置于恒温水浴锅中,85 ℃水浴边振荡边进行皂化反应30 min。反应完全后,将溶液放置至室温,用水将全部皂化液转移到100 ml容量瓶中,用水定容至刻度,摇匀。(试验过程应尽量避光,且在通风橱中进行。)     
1.2.2.2固相萃取过程[8]
        将固相萃取柱放置在固定的试管架上,将下口敞开,准确移取20.0 ml皂化液至固相萃取柱上,待皂化液慢慢流下,但不能流出固相萃取柱,待溶液完全被吸附,等待10 min后,使用含有质量分数为0.1% BHT的正己烷溶液进行洗脱,洗脱过程中,固相萃取柱下方应连接注射器针头,并将针头下方放入100 ml棕色容量瓶中,分4次向固相萃取柱上方放入洗脱液,每次25 ml,收集全部洗脱液,使用正己烷定容至刻度,摇匀备用。(试验过程应尽量避光,且在通风橱中进行。)     
1.2.3色谱条件
        Agilent Zorbax C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相为甲醇,流速为1.0 ml/min,进样量20 μl,检测波长为维生素A:325 nm,维生素E:294 nm。
     1.2.4测定
        准确移取10.0 ml正己烷溶液,放入离心管中,于40 ℃下氮吹近干,使用乙醇复溶并定容至2.0 ml,并旋涡30 s,将此溶液过0.45 μm上机测定。
2结果    
2.1皂化提取过程
        除了乳制品本底所带入的之外,婴幼儿配方粉中所含的维生素A和维生素E主要均是在生产过程中添加的,维生素A和维生素E均对光敏感,见光易分解,因此在添加过程中,需将维生素A和维生素E进行醋酸酯化,并进行微囊化,以保证在食品运输和贮藏过程中维生素A和维生素E的稳定和不流失。为了准确测定婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E的含量,应同时将乳制品本底中和生产过程中添加的所有待测物进行测定,需要将不同形态的维生素A和维生素E变为统一形态后再进行测定。     
2.1.1脂肪类物质的去除
        婴幼儿配方粉中脂溶性维生素的提取是一个难题,首先乳粉中含有大量的脂肪物质,脂溶性维生素在破壁后往往和乳粉中的脂肪紧密结合,无法被溶剂有效完全的提取,或者在检测过程中对目标待测物形成一定的干扰,因此脂溶性维生素的提取过程中均需要去除脂肪以增加提取效率并消除干扰,常采用的方法分别为脂肪酶解法和皂化法。两者均能将乳粉中的脂肪类物质除去,但是和脂肪酶解法相比较,皂化法不仅能除去脂肪的干扰,还能将原本添加的维生素A和维生素E的醋酸酯转化为维生素A和维生素E,因此两者相比较,皂化法更加适合婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E两种待测物的提取。     
2.1.2加入抗坏血酸和乙醇
        维生素A和维生素E容易被氧化,因此在皂化过程中应采用氮气保护密封皂化,且应在溶液体系中加入抗氧化剂抗坏血酸,目的是为了防止目标提取物在皂化过程中被溶液体系中溶解的氧气氧化。乙醇在皂化反应过程中的作用有两个,第一作为皂化反应的催化剂,作为载体可以使氢氧化钠溶液和油脂充分结合以达到加快反应的目的,第二增加待测物在溶液体系中的溶解性,保证了待测物的充分提取。     
2.2固相萃取过程     
2.2.1固相萃取的原理
        EXtrelut NT20固相萃取柱其填料为特殊处理的大孔硅藻土[9],具有很大的孔体积[10],且具有化学惰性,当溶液放入固相萃取柱时,会被这些多孔吸附,当使用弱极性的溶液对固相萃取柱上残留的物质进行洗脱时,只能将弱极性的物质有选择的洗脱下来,而极性较强的干扰物仍旧保留在固相萃取柱上。当上样量为20.0 ml时,使用100 ml的正己烷洗脱时可将目标待测物完全洗脱下来。     
2.2.2固相萃取过程对待测物的保护
        在固相萃取柱上加入皂化液时,如果有液体流出固相萃取柱,那么将会有待测物的损失,因此务必保证皂化液全部被固相萃取柱吸附;同时,待测物质见光易分解且容易被氧化,因此在整个过程中要尽量在暗室进行,且洗脱液中加入抗氧化剂BHT保证待测物的稳定。     
2.2.3洗脱液的选择
        洗脱过程主要依靠物质的极性来进行目标待测物的洗脱,常见的弱极性洗脱溶剂有石油醚、乙醚和正己烷,这3种溶剂均能对目标待测物进行良好的洗脱且易于进行浓缩。因为洗脱过程需要分次添加洗脱液,在洗脱时会存在洗脱液挥发的情况,最终选择正己烷作为洗脱液对目标待测物进行洗脱。     
2.3色谱条件
        试验选择的色谱柱为安捷伦Zorbax C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以甲醇为流动相的条件下,柱温为室温,维生素A和维生素E能够完全分离,在PDA检测下扫描,得到维生素A和维生素E的最大吸收波长分别为325和294 nm。检测器选择变波长分段采集,标准物质色谱图和样品上机液色谱图分别见图1和2。
图1标准物质色谱图
     Figure 1Standard chromatogram    
  图2样品处理液上机色谱图
     Figure 2Sample chromatogram       
2.4方法的线性关系和检出限
        试验结果表明,维生素A和维生素E在标准系列工作溶液范围内有良好的线性关系,维生素A的线性方程为y=5.40×104x+2.75×103,相关线性系数为0.999,维生素E线性方程为y=7.09×103x+2.35×103,相关线性系数为0.999。分别以3倍 信噪比和10倍信噪比作为样品处理上机液的检出限浓度和定量限浓度,得到维生素A的检出限和 定量限分别为1.0、3.0 μg/100 g;维生素E的检出限和定量限分别为10、30 μg/100 g。     
2.5精密度与回收率
        选择实验室检毕样品作为样品同时测定维生素A和维生素E的含量,平行测定6次,得到结果分别为维生素A:509.4、522.8、521.9、525.9、501.0、516.9 μg/100 g,相对标准偏差(RSD)为1.83%;维生素E为4.86、5.12、5.01、4.86、4.79、4.88 mg/100 g,RSD为2.47%。向已知浓度的婴幼儿配方粉样品中添加高、中、低3个浓度水平进行回收试验,平行3份。结果见表1。
表1已知浓度样品三水平加标回收率(n=3)
Table 1Three level recovery rate of samples    
2.6实际样品测定
        选择实验室在监督抽查中抽取的剩余样品,按照本方法进行维生素A和维生素E的测定,得到结果见表2,从测定结果可见,所有样品的测定结果,均在样品标示值的范围之内。
表2样品测定值与标示值结果的比较
     Table 2Comparison of the results between the measured 
     values and the marked values    
3小结
        婴幼儿配方粉中脂溶性维生素的检验前处理过程较为复杂,不同实验室对同一样品的检测结果也往往出现很大偏差,究其原因,是因为国家标准中规定的检验方法可操作性差,检测周期较长,不利于试验操作。本检测方法的建立,使用了更为高效的固相萃取的方法代替了国家标准中使用的传统液液萃取的方法,对皂化液中待测组分进行提取,此方法不仅避免了在液液萃取中两相界面出现乳化的现象,还缩短了试验时间;同时在提取液的浓缩过程使用了氮吹的浓缩方法代替了国家标准中规定的旋转蒸发浓缩的方法,提高了检测效率;本检测方法简化了操作步骤,提高了试验效率,使得多批次样品同时进行前处理操作变得可行,且经过方法学验证,能够满足日常检验,在实际样品测定中,检测结果也能在样品的标示值范围之内,可以作为实验室检验婴幼儿配方粉中维生素A和维生素E的检验方法使用。
参考文献
[1]王际龙,张现红,马长礼. 维生素A的生理作用及其缺乏的临床症状[J]. 山东畜牧兽医,2014,35(7):23-24.
[2]雷炳福,孙登文. 维生素E的生理作用与营养[J]. 西部粮油科技,1996,21(3):19-23.
[3]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准 较大婴儿和幼儿配方食品:GB 10767—2010[S].北京: 中国标准出版社,2010.
[4]中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准 婴儿配方食品:GB 10765—2010[S].北京: 中国标准出版社,2010.
[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局. 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定:GB 5009.82—2016[S].北京: 中国标准出版社,2016.
[6]朱姜,张鹏,杨嘉,等. 高效液相色谱-串联质谱法测定奶粉中的维生素A、维生素D、维生素E[J]. 中国卫生检验杂志,2015,25(11):1733-1736,1739.
[7]张敏,唐俊,黄丽. 固相萃取-梯度高效液相色谱法同时测定婴幼儿食品中维生素A、D、E的含量[J]. 中国食品添加剂,2014(9):190-194.
[8]赵榕,薛颖,吴国华,等. 固相萃取-高效液相色谱法测定钙强化食品中的维生素D[J]. 色谱,2008,26(1):113-115.
[9]袁巍巍. 硅藻土基多孔矿物复合材料制备及其对有机污染物的吸附/催化性研究[D].广州:中国科学院广州地球化学研究院,2016.
[10]吴玉红,谭家镒. 硅藻土固相萃取在毒物分析中的应用[J]. 中国人民公安大学学报(自然科学版),2006,12(4):6-10.