DOi:10.13590/j.cjfh.2018.02.018 
创伤弧菌致病性及致病机制研究进展 
叶淑瑶1,2,杨保伟2,李凤琴1

(1.国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室,北京100021;      2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西 杨凌712100)

收稿日期:2018-02-21

作者简介:叶淑瑶女硕士生研究方向为微生物食品安全     E-mail: yeshuyao75@163.com     
通信作者:李凤琴女研究员研究方向为食品微生物     E-mail: lifengqin@cfsa.net.cn

基金项目:

摘要:创伤弧菌广泛存在于海水和牡蛎等海产品中,具有很强的细胞毒性和溶血性,被美国疾病预防控制中心(CDC)列为三大致病性弧菌之一。本文就创伤弧菌在食品中的污染状况,人类感染途径及临床表现,致病性、致病机制和检测方法等进行综述,以期为该菌感染的预防和治疗提供理论依据。
关键词: 创伤弧菌; 食源性致病菌; 污染水平; 致病性; 致病机制; 检测方法
文章编号:1004-8456(2018)02-0213-07     中图分类号:R155     文献标志码:R    
Research progress on pathogenicity and pathogenic mechanism of Vibrio vulnificus
YE Shu-yao1,2, YANG Bao-wei2, LI Feng-qin1
(1.Key Laboratory of Food Safety Assessment of Ministry of Health, China National Center     for Food Safety Assessment, Beijing 100021,China; 2.Collage of Food Science and     Engineering, Northwest A&F University, Shaanxi Yangling 712100,China)
Abstract:Vibrio vulnificus widely exists in oysters and seawater. It has been recognized as one of the three major pathogenic Vibrio spp. because of its strong cytotoxicity and hemolysis. In this paper, the contamination status of Vibrio vulnificus in food, prevalence, pathogenicity, pathogenic mechanism and detection method are reviewed, so as to provide theoretical basis for the prevention and treatment of the infection.
Key words: Vibrio vulnificus; foodborne pathogens; contamination status; pathogenicity; pathogenic mechanism; detection method
       创伤弧菌是一种革兰阴性弧菌,呈棒状或弧状,兼性厌氧,单极端生鞭毛。该菌有3个生物型,其中生物Ⅰ型和生物Ⅱ型分别感染人类和鳗鱼,但近年来研究发现生物Ⅱ型中仅有血清型E菌株对人类有致病性,生物Ⅲ型仅在以色列发现,被认为是生物Ⅰ型和Ⅱ型的杂交体,也有致病性的报道[1-3]。根据毒力相关基因(virulence correlate gene,VCG),创伤弧菌又可分为环境型和临床型两大类,这两种基因型菌株分别携带大量特异性基因,从而增强了它们对环境的适应性和致病性[4-5]
        创伤弧菌广泛存在于海湾和咸水水域,在5~10月期间沿海水域的污染水平较高。主要通过伤口接触海水造成感染,也可经口感染,食用牡蛎等贝类是引起人类感染创伤弧菌的主要途径,感染后病情严重程度和致死率远超其他致病性弧菌,死亡率高达18%,人食用被污染的海产品感染创伤弧菌后通常易患原发性败血症,即使救治及时,死亡率仍高达50%;皮肤有伤口的人游泳或接触被该菌污染的水域是导致伤口感染创伤弧菌的主要原因,严重感染者需大面积清创甚至截肢[6]。这两种感染途径都会使患者承受极大的身心痛苦和沉重的经济负担。美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control,CDC) 将创伤弧菌列为三大致病性弧菌之一。本文就近年来创伤弧菌在食品中的污染状况、人类感染途径及临床表现、致病性、致病机制和检测方法等进行综述,以期为该菌的预防和治疗提供理论依据。
1创伤弧菌污染状况和人类感染途径及临床表现
1.1创伤弧菌污染状况
        创伤弧菌广泛存在于近海水体、海底淤泥和海产品中,富含蛋白质的牡蛎、毛蚶、贻贝、对虾的污染率和污染水平较高,海鱼中该菌的污染水平较低。由于创伤弧菌是嗜盐菌,因此在淡水鱼虾中少见。美国CDC报道[7]称美国海域水温相对较高的5~10月期间,食品和环境中的创伤弧菌污染水平较高,这可能与这一时期飓风和热带风暴引起洪水导致人暴露于海水中的可能性增大有关。部分国家或地区海产品中创伤弧菌的污染情况见表1。
        表1创伤弧菌在海产品中的污染状况
       Table 1Contamination of Vibrio vulnificus in seafood
1.2人类感染途径及临床表现
        据美国CDC报道[22-23],美国每年由各种弧菌引起的病例约有80 000例,其中52 000例是由于食用了被污染的水产品,多数患者1~3 d内能恢复且无后续影响,但是感染创伤弧菌的患者通常病情较重,需要进行重症监护甚至截肢,约有1/4的创伤弧菌感染患者在发病1~2 d内死亡。2014年,美国霍乱和其他弧菌疾病监测系统(the cholera and other vibrio illness surveillance system,COVIS)统计了1 252例弧菌属感染病例,其中由创伤弧菌引起的有124例,死亡率高达18%[7]。国内创伤弧菌感染的病例少见,这可能与我国缺乏对该菌的监测有关。2015年我国科学家ZHAO等[24]报道了2000—2014年间中国东南部仅有21例创伤弧菌感染者,其中4人死亡。HSU等[25]报道了中国台湾地区2005—2012年间19例创伤弧菌感染者,其中2人死亡。虽然创伤弧菌感染在我国报道较少,但是近年来调查表明,我国以牡蛎为主的海产品中创伤弧菌的污染率较高,加上大众对于生食海鲜的喜爱,导致我国居民感染创伤弧菌的风险增加,必须引起重视。
        免疫力低下者(如地中海贫血症患者、接受免疫抑制疗法的患者)、肾病患者、慢性肝病患者、糖尿病患者、恶性肿瘤患者、酒精中毒者以及因服药导致胃酸水平下降或近期有胃部手术的患者为易感人群[7,26-27]。感染途径主要是生食或食用未彻底加热的贝类,特别是牡蛎,这已成为美国感染创伤弧菌和致死的主要原因;另外,开放性伤口暴露于海水或含盐量较高的咸水环境也提高了感染创伤弧菌的风险。人体感染创伤弧菌后,菌体在皮下组织中迅速繁殖而引起皮肤大面积损伤,致死率达15%~30%。创伤弧菌感染可引起两种疾病:1)原发性败血症,创伤弧菌透过肠粘膜进入血液,导致患者出现全身中毒症状,如发烧、寒颤、血压降低、下肢及软组织损伤(表现为下肢疼痛肿胀、局部红斑、淤斑坏死、大疱性皮肤损害、蜂窝组织炎)以及腹痛、腹泻、恶心、呕吐等肠胃炎症状[28-29]。美国每年大约有20~40例创伤弧菌感染引起原发性败血症的患者,其中50%是由于肾病和血清铁水平升高而死亡[7]。2)创伤感染,多见于四肢伤,皮肤损害表现与原发性败血症相同并向躯干蔓延,同时伴有发热、寒颤、恶心、呕吐等症状[28-29]。其中,原发性败血症的致死率远高于伤口感染。
        2014年,美国传染病协会(the Infectious Diseases Society of America,IDSA)更新了皮肤及软组织感染的治疗指导方针,建议使用多西环素联合头孢他啶治疗创伤弧菌感染[30]。美国CDC则进一步提出复方磺胺甲噁唑联合氨基糖苷类药物作为儿童感染用药,氟喹诺酮类药物如左氧氟沙星、环丙沙星、加替沙星等单剂疗法在动物模型中效果等同于上述联合用药[7]。有研究[31]表明替加环素在皮肤及软组织感染中表现出较好的治疗效果。中国学者卢中秋等[29]在治疗研究中发现乳酸左氧氟沙星、哌拉西林钠、头孢哌酮钠、奈替米星的治疗效果最好。
2毒力因子及致病机制
2.1溶血素
        创伤弧菌可产生由结构基因vvhA编码的创伤弧菌溶血素(Vibrio vulnificus haemolysin A,VvhA),该溶血素是一种具备创伤弧菌种属特异性,活性和毒性都很强的细胞外蛋白,属于孔形成蛋白家族中的胆固醇依赖型溶细胞素[32]。VvhA是创伤弧菌引发细胞、组织损伤的重要毒力因子,作用机制主要包括细胞毒性和诱导细胞凋亡两方面。VvhA的细胞毒性机制是与细胞膜上的非酯化胆固醇结合并在细胞表面聚集,使细胞膜形成孔道导致胞内钾离子外流,引起胶体渗透性细胞破裂。研究[33]表明,VvhA与胆固醇的结合依赖于胆固醇的立体结构,低密度脂蛋白胆固醇使VvhA寡聚导致其失活。VvhA诱导细胞凋亡的主要机制与线粒体有关。VvhA可诱导产生超氧化物一氧化氮酶(NOS),通过该酶催化大量一氧化氮合成而引起宿主组织损伤,导致低血压和休克。肺是VvhA作用的重要靶器官,SUN等[34]通过重组溶血素rVvc作用于肺腺癌细胞A549,证明细胞凋亡是由线粒体损伤激活cytc-c capspase-9/3细胞凋亡机制与bcl-2基因表达下调、bax基因表达上调引起的。
        创伤弧菌还可以分泌另一种溶血素MARTX(multifunctional autoprocessing repeats in the toxin),该溶血素是由rtxA1基因编码,具有类似RTXA(repeats in the toxin A)的特征,需经过翻译修饰后方可发挥作用。MARTX的C端有富含甘氨酸的重复序列,通过Ⅰ型分泌系统转运至胞外,需结合钙离子才能表现出细胞毒性。MARTX毒素与VvhA的致病机制类似,也具有细胞溶解和诱导细胞凋亡的能力,可作用于包括人类、老鼠、鱼和鳗鱼的红细胞、上皮细胞和吞噬细胞等多种真核细胞[33-35]。MARTX毒素可使吞噬作用相关的SFKs-FAK/Pyk2-PI3K-Akt信号通路无效化,从而导致巨噬细胞圆缩,吞噬作用受损[36]。创伤弧菌生物Ⅱ型分泌的MARTX毒素可导致人上皮细胞溶解及单核细胞凋亡并引起早期剧烈的免疫反应失调[37]。研究[33]表明,MARTX的细胞毒性远大于VvhA,对小鼠的致死效果也更加明显。两种毒素均能促进创伤弧菌在小肠内的生长繁殖并转移到其他组织,以逃避机体的吞噬作用。
2.2蛋白酶
        创伤弧菌蛋白酶(Vibrio vulnificus protease,VVP)是由创伤弧菌分泌至胞外的锌离子依赖金属蛋白酶,属于嗜热菌蛋白酶家族,具有很强的细胞毒性和溶血能力,可促进菌体从肠道侵入血流,其编码基因vvpE具有高度的保守性[38-39]
        成熟的VVP包含两个功能区域,即氨基端(VVP-N)和羧基端(VVP-C)。VVP-N能介导蛋白水解反应,降解构成血管基膜骨架的Ⅳ型胶原蛋白导致毛细血管结构破坏,引起严重的出血性皮肤损伤[40]。VVP-C区域可介导与底物蛋白或细胞膜的有效连接,增强VVP-N的作用效果[41]。VVP还能诱导肥大细胞释放组胺并激活因子XII,促进前血管舒缓素向血管舒缓素转化,血管舒缓素作用于血浆中的激肽原,释放缓激肽从而导致水肿[42]。最近研究[43]表明,缺乏粘液素(Muc 2)会导致严重的结肠炎,而VVP可促进muc 2基因启动子特定区域的甲基化使得muc 2基因转录受到抑制,明显降低人黏液分泌细胞HT29-MTX中Muc 2水平,提高创伤弧菌对内皮细胞的粘附性和肠壁渗透性。
        部分鳗源创伤弧菌致病菌株中vvpE基因缺失,分泌一种新的创伤弧菌丝氨酸蛋白酶(Vibrio vulnificus serine protease,VvsA)代替VVP,这种酶与副溶血性弧菌胞外蛋白酶同源,具有多种细胞毒性,能引起人类伤口感染和胃肠炎,是导致出血性水肿的重要原因[44]
2.3荚膜多糖
        创伤弧菌荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)在抵抗宿主的免疫反应过程中起重要作用,能抵抗巨噬细胞的吞噬作用、抗体和补体的调理作用以及血清补体的杀菌作用;此外,CPS还能包裹创伤弧菌表面的免疫原性结构,避免激活宿主的非特异性免疫反应。CPS也是创伤弧菌胞外基质的主要成分,参与组成生物膜,从而增强细菌抵抗宿主免疫反应的能力。有研究[45]表明,CPS能促进人肠上皮细胞细胞因子IL-8产生导致炎症加重。CPS的合成受到转录反终止子rafH在转录水平的调控,rafH突变会导致CPS产量减少,血清抗性几乎完全消失[46]
2.4铁过载
        铁元素是人体必需微量元素,在人体中以结合血红素构成血红蛋白或结合血液中的铁传递蛋白和乳铁传递蛋白的形式存在[47]。铁元素也是创伤弧菌的必需营养素,对促进该菌在血液中的增殖至关重要。创伤弧菌有多种铁吸收系统,当血液中的游离铁含量低时,创伤弧菌能够合成作为铁载体或铁螯合剂的创伤弧菌素,与创伤弧菌素受体(VuuA)共同作用争夺宿主机体内铁离子。慢性肝病、血色素沉着症、地中海贫血患者肝脏合成的铁结合蛋白减少,导致机体内游离铁离子含量升高,促进创伤弧菌增殖[48]。铁元素还是CPS合成的必需元素,创伤弧菌分泌铁吸收调节蛋白(Fur)对VuuA,需氧菌素受体(IutA)和血红素受体(HupA)进行负调控,减少荚膜多糖合成,也能导致荚膜多糖抵抗血清的能力下降[48-49]
        创伤弧菌致病机制复杂,至今尚未完全阐明,一般认为该菌所致疾病是多致病因子、多途径共同作用的结果,除了以上几种主要的致病因子之外,菌毛、鞭毛、脂多糖、磷脂酶等也与创伤弧菌的致病性有关。
3创伤弧菌检测方法
3.1增菌培养法
        目前国际上常用的创伤弧菌检测方法包括美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)发布的细菌分析学手册(bacteriological analytical method,BAM)第九章、国际标准化组织(International Standard Organization,ISO)发布的ISO/TS 21872-2: 2007、加拿大卫生部发布的MFLP-37以及日本厚生省发布的食品卫生检查指南[50-53]。FDA发布的BAM-2004提供的第一法是最大可能数(most probable number,MPN)法,将海产品匀浆在碱性蛋白胨水(alkaline peptone water,APW)中增菌后在改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E (modified cellobiose-polymyxin B-colistin,mCPC)琼脂平板或纤维二糖-多粘菌素E (cellobiose-colistin,CC)琼脂平板上划线分离,对纤维二糖阳性菌落进行生化鉴定或基于whA基因的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定。第二法是将海产品组织匀浆稀释物涂布于创伤弧菌琼脂(vibrio vulnificus agar,VVA)平板上,培养后在平板上覆盖滤膜以粘附菌落,裂解滤膜上的菌体释放DNA使之与基于whA基因设计的探针杂交[50]。加拿大MFLP-37建议使用mCPC作为创伤弧菌分离用培养基,鉴定方法仅介绍了常规生化鉴定[52]。ISO 2017年对方法进行了更新,提供了生化鉴定、PCR和荧光定量PCR作为可选的鉴定手段[54]
        以上增菌培养法均耗时费力,不适用于活的非可培养(viable but non-cultural,VBNC)创伤弧菌检测。根据创伤弧菌的生化或分子特性,为能快速、准确地检测创伤弧菌,国内外学者利用免疫法或基于PCR已建立了多种快速检测方法。
3.2免疫学方法
        免疫学方法具有操作简单、特异性强、灵敏度高、检测时间短且结果易于观察的特点。TAMPLIN等[55]建立了基于创伤弧菌特异性单克隆抗体FRBT37的酶免疫法(enzyme immunoassay,EIA),该法的最低检出限为2 000个菌/孔,准确率达99.7%,曾是FDA的BAM认可的创伤弧菌鉴定方法。古小莉等[56]利用创伤弧菌外膜蛋白作为抗原,建立的创伤弧菌斑点酶联免疫法特异性好,创伤弧菌显色明显且与其他杂菌无交叉反应,灵敏度比TAMPLIN等建立的方法提高了1倍,为103 CFU/ml,对增菌后的增菌液检测效果与常规方法一致,具有快速、经济和肉眼可见等优点。曾静等[57]利用创伤弧菌鞭毛蛋白作为抗原,制备单克隆抗体mAb并建立了创伤弧菌双抗夹心酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),方法灵敏度也达到了103 CFU/ml,与创伤弧菌有强阳性反应而与其他杂菌无交叉反应,可用于商品化试剂盒的开发,具有良好的应用前景。
3.3分子检测方法
        由于与其他杂菌存在竞争关系,酶免疫法无法检测到样品中的创伤弧菌,而PCR等分子检测方法特异性强、灵敏度高,更适合污染水平较低的样品中创伤弧菌的检测。WRIGHT等[58]设计的碱性磷酸酶标记寡核苷酸探针通过核酸杂交检测创伤弧菌以及HILL等[59]基于vvhA基因的PCR方法已成为FDA的BAM中对创伤弧菌特异性计数和鉴定的重要方法。CAMPBELL等[60]于2003年建立了基于vvhA基因的实时荧光定量PCR检测牡蛎中创伤弧菌,该方法已被ISO/TS 21872采纳作为创伤弧菌确证方法之一。
        WEI等[61]于2014年设计了针对包括创伤弧菌在内的4种致病性弧菌多重PCR方法,并以16S rRNA基因保守区作为扩增内标,建立的方法检出限达到10 CFU/管,与生化鉴定结果的符合率高,适用于菌群复杂的样品检测。随后,KIM等[62]设计了6对多重PCR引物对环境样品中包括创伤弧菌在内的5种致病性弧菌进行快速检测,且不同种弧菌之间、弧菌与其他非弧菌之间均没有交叉反应。KIM等[63]建立的多重荧光定量PCR方法对鱼类样品中创伤弧菌的检出限可达10 CFU/ml,对海水样品中该菌的检出限达到了1 CFU/ml。
        环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是近年来新兴起的基因诊断技术,该技术是在链置换型DNA聚合酶的作用下,设计一对外引物和两对内引物来识别靶基因的6个区域,恒温(60~65 ℃)条件下1 h内就可对目的基因进行高效、特异的复制,操作简单快速,仪器依赖性小,适合现场快速检测[64]。ZHOU等[65]设计了四重弧菌LAMP检测技术,以创伤弧菌金属蛋白酶基因(GenBank No. U50548.1)为靶基因设计引物,结果表明引物特异性良好,检测限为8×103 CFU/ml,比单纯利用外引物进行PCR检测灵敏100倍。LAMP技术灵敏度高,但操作中易受污染导致假阳性率高,为解决该问题,王耀焕等[66]将LAMP与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)检测联合应用,针对创伤弧菌的外膜蛋白TolC基因设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,生物素标记的LAMP扩增产物特异性地与FITC标记的探针杂交,杂交产物经LFD检测。完成检测仅需要80 min,对纯细菌培养物的检测灵敏度为3.7×102 CFU/ml或7.4 CFU/反应,是利用外引物进行常规PCR检测的100倍。
        刘德婧等[67]通过指数富集的配基系统进化技术 (systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到一条高亲和力、强特异性的创伤弧菌适配体V8并进行5’-FITC修饰,与菌体碎片杂交后利用流式细胞仪进行计数,检测限达到了28 CFU/ml,速度快,尤其适用于VBNC状态下的创伤弧菌检测。核酸适配体还可与量子点、胶体金显色等检测手段联用,使检测更加快速灵敏,是极为理想的检测元件。郭微微等[68]则根据16S rDNA和gyrB保守区扩增产物设计并筛选得到针对包括创伤弧菌在内的7种港口航道致病菌的探针,经氨基化修饰后点制芯片。样品增菌后提取DNA对16S rDNA和gyrB保守区PCR扩增后与芯片杂交,结果表明建立的基因芯片检测方法灵敏度高,可实现快速、高通量、准确的检测。
        综上所述, 鉴于创伤弧菌的致病性及在食品中的广泛分布,有必要加强创伤弧菌在我国的污染情况及病例报告的监测,而我国目前尚未有针对从环境到餐桌整个流通过程中创伤弧菌污染模型和人体感染创伤弧菌的剂量-反应关系评估,发展灵敏、特异、简便的海产品中创伤弧菌检测方法,对不同类别海产品中该菌污染水平进行监测,并开展创伤弧菌耐药性及致病机制的深入研究,以此为依据开展膳食暴露创伤弧菌对我国居民健康影响的风险评估,制定我国食品中创伤弧菌的限量标准等是未来研究的重点,为感染后临床用药和治疗带来极大帮助。
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