DOi:10.13590/j.cjfh.2018.03.001
反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响 
范荣,孙昊,席元第,周催,吕晨艳,杨春,蔡夏夏,肖荣,麻微微

(首都医科大学公共卫生学院,北京100069)

收稿日期:2018-04-02

作者简介:范荣女硕士生研究方向为营养与老年相关慢性疾病E-mail: fanrong53782@sina.com  
通信作者:麻微微女副教授研究方向为营养与老年相关慢性疾病E-mail: weiweima@ccmu.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金项目(81472982,81773406);北京市教育委员会科技发展计划一般项目(KM201710025007)

摘要:目的研究反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞,加入不同剂量(0、10、20、50和100 μmol/L)的反油酸,24 h后收集细胞,采用透射电镜观察细胞自噬小体;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞活力;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞自噬相关的基因和蛋白表达水平。结果透射电镜观察细胞结构发现,50和100 μmol/L反油酸可使细胞内出现自噬小体,并可以引起细胞活力下降,差异均有统计学意义(P<0.01);100 μmol/L反油酸作用24和48 h后,细胞活力明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞中细胞色素C(cytochrome c,cyt-c)基因mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);随着反油酸浓度的升高,细胞浆中cyt-c蛋白表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。但是不同剂量的反油酸对SH-SY5Y细胞自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)基因、Beclin1基因、p62基因、自噬相关基因5(atg5)、自噬相关基因12(atg12)mRNA水平表达差异无统计学意义(P>0.05);但与对照组比较,50和100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论反油酸可以引起人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞活力下降,可能与其引起细胞自噬小体形成,上调自噬相关蛋白表达水平,促进线粒体cyt-c蛋白释放入细胞浆有关。
关键词: 反式脂肪酸; 反油酸; 线粒体; 细胞自噬; 人神经母细胞瘤细胞; 神经退行性疾病; 基因; 细胞色素C; 蛋白
文章编号:1004-8456(2018)03-0223-06     中图分类号:R155     文献标志码:A    
Effect of elaidic acids on mitochondrial function and autophagy in SH-SY5Y cells
FAN Rong, SUN Hao, XI Yuan-di, ZHOU Cui, LYU Chen-yan, YANG Chun, CAI Xia-xia, XIAO Rong, MA Wei-wei
(School of Public Health,Capital Medical University,Beijing 100069,China)
Abstract:ObjectiveThe aim of this study was to determine the effects of elaidic acid on mitochondrial function and autophagy in the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. MethodsSH-SY5Y cells were cultured in vitro and treated with different concentrations (0, 10, 20, 50 and 100 μmol/L) of elaidic acid for 24 hours. The morphology of cells and intracellular autophagosomes were observed by transmission electron microscope. The cell viability was detected by using CCK-8 detection kit. Real-time polymerase chain reaction(PCR)and western blot were used to measure the autophagy-related genes and proteins expression. ResultsObservation of cell structures found that intracellular autophagosomes formed with 50 and 100 μmol/L of elaidic acid. 50 and 100 μmol/L of elaidic acid might result in a decline in cell viability (P<0.01). 100 μmol/L of elaidic acid significantly decreased cell viability both after 24 and 48 h (P<0.05). 100 μmol/L of elaidic acid significantly decreased the cytochrome c (cyt-c) gene mRNA expression in SH-SY5Y cells (P<0.05). The expression level of cyt-c protein in the cytoplasm was gradually elevated with the increase of elaidic acid concentrations (P<0.05). But the differences with regard to the LC3B, Beclin1, p62, atg5 and atg12 genes mRNA expression levels of SH-SY5Y cells were not significant across different doses(P>0.05). 50 and 100 μmol/L of elaidic acid gave rise to the expression of LC3B and Beclin1 proteins up-regulated compared with the normal group (P<0.05). ConclusionElaidic acid contributes to the decrease of SH-SY5Y cells viability, which may be associated with the formation of autophagosomes, up-regulating autophagy protein expression, promoting the changes of mitochondrial permeability and releasing mitochondrial cyt-c protein into cytoplasm.
Key words: Trans fatty acids; elaidic acid; mitochondria; autophagy; SH-SY5Y cells; neurodegenerative diseases; genes; cytochrome c; protein
    反式脂肪酸(trans fatty acids,TFAs)属于不饱和脂肪酸,包括单不饱和TFAs和多不饱和TFAs,其化学结构分别对应一个或多个非共轭的双键构型[1]。近年来,有研究[2]表明,长期摄入富含TFAs的食物与老年痴呆症等神经退行性疾病的发生发展具有一定关联。研究[3]发现,TFAs能穿过血脑屏障,与脑中脂质结合,抑制长链多不饱和脂肪酸的合成,加速神经退行性疾病的病程[4]。细胞自噬是清除细胞内蛋白质聚集体的重要途径[5],适当的自噬过程可以促进疾病的恢复,而非正常自噬则将使疾病恶化[6-7]。线粒体是细胞凋亡调控中心,在细胞自噬的发生中具有重要作用。综上所述,TFAs可能通过调节细胞自噬水平和线粒体功能来影响认知功能,但具体机制尚不明确,因此,本研究拟采用TFAs的主要成分反油酸(elaidic acid)为研究对象,探讨其对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞自噬和线粒体功能的影响,为研究神经退行性疾病发病机制及其相应治疗方案提供基础数据和科学依据。   
1材料与方法     
1.1材料   
1.1.1细胞来源
        人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞来源于北京协和细胞资源中心。     
1.1.2主要仪器与试剂
        恒温CO2培养箱,IX71型倒置显微镜(日本Olympus),HT7700型透射电子显微镜(日本HITACHI),Infinite M200 PRO多功能酶标仪(奥地利Tecan),PTC-0200型 DNA Engine Peltier Thermal Cycler热循环仪、CFX ConnectTM 荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测系统、蛋白免疫印迹(western blot)检测设备均购自美国Bio-Rad。
        改良杜氏伊格尔培养基(DMEM,美国Corning),青霉素-链霉素混合液、胰蛋白酶、 细胞计数试剂盒8(CCK8) 均购自江苏凯基生物技术股份有限公司,胎牛血清、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PB)、0.01 mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)均购自美国HyClone,二甲基亚砜(DMSO)、反油酸(纯度≥99.0%)均购自美国Sigma,细胞总RNA提取试剂盒(美国Promega),RevertAidTM第一链cDNA合成试剂盒(德国Thermo),通用型SYBR快速定量PCR试剂盒(美国KAPA),线粒体和胞浆蛋白制备试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司),自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)多克隆抗体、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体均购自美国CST,Beclin1多克隆抗体、孔蛋白-线粒体内参照(VDAC1)多克隆抗体(美国Abcam),LC3B、Beclin1、自噬相关基因5(atg5)、自噬相关基因12(atg12)、p62、β-actin基因合成引物均由上海生工生物工程有限公司提供。     
1.2方法   
1.2.1溶液的配制
        1 g反油酸完全溶于3.54 ml DMSO中,配制成1 mol/L储备液后,用DMEM稀释为10 mmol/L工作液,分装在离心管中,-80 ℃保存。染毒前,将工作液稀释为400 μmol/L,采用倍比稀释的方法进行染毒,同时,采用和反油酸同样的方法配制溶剂对照。
1.2.2细胞培养
        用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 g/ml链霉素的DMEM培养基于37 ℃、5.0% CO2培养箱中培养SH-SY5Y细胞。
1.2.3细胞分组与处理
        将SH-SY5Y细胞以2.0×105/ml接种于25 cm2培养瓶中24 h后染毒,各组反油酸的剂量分别为0(对照组)、10、20、50、100 μmol/L,继续培养24 h后收集细胞备用。     
1.2.4细胞形态学观察
        将各组细胞用0.01 mol/L PBS洗涤3次,胰酶消化后,1 000 r/min离心5 min,弃上清收集细胞。使用含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 mol/L PB固定细胞3 h,弃固定液,用0.1 mol/L PB清洗样品3次,每次10 min,将固定细胞放入2%琼脂糖凝胶中,用4%锇酸固定1 h,使用预冷0.1 mol/L PB清洗,醋酸双氧铀染色1 h后梯度乙醇(30%、60%、70%、90%及100%)脱水,采用环氧树脂包埋并制作超薄切片,以5%醋酸双氧铀和2%枸橼酸铅双重染色后,在透射电子显微镜下观察细胞超微结构并拍照。     
1.2.5CCK8检测细胞活力
        将细胞以1.0×106/ml接种于96孔板中,设5组,每组6孔,每孔加细胞悬液100 μl,在37 ℃、5.0% CO2培养箱中培养24 h使细胞完全贴壁后,将每孔原始培养基取出,置换为无血清培养基配制的反油酸,每组浓度分别为10、20、50、100 μmol/L,同时设置对照组(0 μmol/L),继续培养24 h,于每孔加入20 μl CCK8试剂(避光保存),孵育4 h后,每孔加入150 μl DMSO,摇床低速振荡10 min,酶标仪570 nm波长测定吸光度(A)值。细胞活力(%)=[A(处理)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100%。重复3次,如结果趋势一致,同时为避免批次间误差,选择其中一次具有代表性的结果。    
1.2.6细胞线粒体的提取
        通过线粒体蛋白制备试剂盒从细胞中分离线粒体和胞浆成分。传代培养的细胞用PBS洗3次,再用胰酶消化后,PBS洗涤,4 ℃、800×g离心5 min收集细胞(每次提取需要2×107个细胞),加入1.5 ml冰预冷的线粒体-细胞缓冲液(mito-cyto isolation buffer,试剂盒提供)重悬细胞,将细胞悬液转移到匀浆器中,于冰上研磨后,4 ℃、800×g离心5 min,收集上清液并转移到新的离心管,再次800×g离心5 min,收集上清液并转移到新的离心管12 000×g离心10 min,管底沉淀即为线粒体。采用western blot方法检测线粒体和 cyt-c蛋 白水平。 1.2.7实时PCR检测细胞自噬相关基因mRNA表达水平
        细胞经反油酸染毒,胰酶消化离心后,加入200 μl RNA裂解液,刮下细胞,按照总RNA提取试剂盒的方法提取细胞中RNA,测定含量后,取1 μg总RNA于无菌EP管中,70 ℃恒温孵育10 min后混匀放置冰上5 min,按照逆转录试剂盒说明书,将RNA逆转录为cDNA,配制逆转录反应体系总体积为20 μl。以cDNA作为模版,使用实时荧光定量PCR仪对β-actin、LC3B、Beclin1、p62、atg5、atg12基因的cDNA全序列进行扩增。参考美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库设计每个基因的特异引物,引物由上海生工生物公司合成(见表1)。PCR程序:95 ℃热启动3 min;95 ℃变性3 s,60 ℃退火/延伸30 s,共40个循环。实时荧光PCR产物用Bio-Rad CFX Manager分析软件进行半定量分析,以β-actin作为内参基因,采用2ΔΔCt法计算mRNA表达相对比值(Ct为循环数),ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组。差别倍数=2ΔΔCt,对照组的数值设为1。试验重复3次。
  表1LC3B,Beclin1,atg5,atg12,p62和β-actin引物序列
     Table 1LC3B, Beclin1, atg5, atg12, p62 and β-actin primerssequence      
1.2.8western blot法检测线粒体及胞浆中cyt-c蛋白及细胞自噬相关蛋白表达水平
        自噬相关蛋白表达水平的检测:细胞经过反油酸染毒孵育24 h后,加入0.5 ml的蛋白裂解缓冲液,用前加苯甲基磺酰氟(PMSF),使PMSF的终浓度为1 mmol/L,充分裂解后,4 ℃涡旋振荡40 min,4 ℃、15 000×g离心15 min,上清液即为总蛋白,用二奎琳甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒进行蛋白定量。
        取60 μg蛋白全细胞蛋白电泳样品,用12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分析,初始电压为80 V,当染料进入分离胶后,电压调到120 V。电泳结束后,用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜进行蛋白的转膜(4 ℃,60 V,2 h)。转膜后,用5%的脱脂牛奶封闭膜1 h后,用蒸馏水冲洗膜3次;用洗膜缓冲液(TBST)稀释一抗,将漂洗后的PVDF膜放入相应抗体中,4 ℃过夜。采用按1∶5 000稀释于TBST的抗兔IgG,室温孵育膜1 h。将漂洗过的膜用增强化学发光法(ECL)显色液显色,暗室里曝光后扫描。观察结果用扫描仪扫描照片,用Fluorchem FC2软件进行图像并分析。以β-actin蛋白作为内参照,用目的蛋白与相应的β-actin蛋白条带平均光密度比值表示目的蛋白的相对表达量。
        将上述提取的细胞线粒体样品按照此western blot步骤检测线粒体及胞浆中cyt-c蛋白表达水平。线粒体中cyt-c蛋白以孔蛋白-线粒体内参照蛋白(VDAC1)作为内参照,胞浆中cyt-c蛋白以β-actin蛋白作为内参照,用目的蛋白与相应的内参照条带平均光密度比值表示目的蛋白的相对表达量。     
1.3统计学分析
        应用SPSS 18.0统计软件进行数据分析,数据比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间比较采用最小显著性差异(LSD)法或Tamhanes法,以P<0.05为差异有统计学意义。所有试验均重复3次或以上。     
2结果
2.1反油酸对SH-SY5Y细胞自噬小体形成的影响
注:放大倍数均为1 500倍;标尺=5.0 μm
     图1反油酸对SH-SY5Y细胞自噬的影响
     Figure 1Effect of elaidic acid on autophagy of SH-SY5Y cells    
         由图1可见,对照组细胞生长良好,未见形态异 常。随着反油酸浓度的升高,SH-SY5Y细胞逐渐皱缩,细胞间隙增大,核固缩,核膜完整但核内结构消失,转为无结构致密均质。50和100 μmol/L组出现低电子密度的自噬小体。  
2.2反油酸对SH-SY5Y细胞活力的影响
        SH-SY5Y细胞加入不同剂量的反油酸后,各组细胞活力均有不同程度的下降。其中,当反油酸浓度为50和100 μmol/L时,作用细胞24 h后,与对照组比较,细胞活力明显降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。SH-SY5Y细胞加入100 μmol/L反油酸作用24和48 h后,细胞活力均明显下降,差异 均有统计学意义(P<0.05),见图2。注:A为不同剂量反油酸作用24 h后对SH-SY5Y细胞活力的影响;B为100 μmol/L反油酸作用不同时间对SH-SY5Y细胞活力的
     影响;*表示与对照组比较,P<0.05,**表示与对照组比较,P<0.01
 图2反油酸对SH-SY5Y细胞活力的影响(n=6)
     Figure 2Effect of different elaidic acid on cell viability of SH-SY5Y cells   
2.3反油酸对SH-SY5Y细胞cyt-c基因和线粒体及细胞浆cyt-c蛋白表达的影响
注:*表示与对照组比较,P<0.05
     图3反油酸对SH-SY5Y细胞cyt-c基因mRNA    表达的影响(n=3)
     Figure 3Effect of elaidic acid on cyt-c gene mRNA expression in SH-SY5Y cells    
        由图3可见,加入100 μmol/L反油酸后,与对照组比较,细胞内cyt-c基因mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。由图4可见,随着反油酸的剂量逐渐增加,与对照组比较,线粒体内cyt-c蛋白水平逐渐降低,但差异无统计学意义(P>0.05);而细胞浆中cyt-c蛋白表达水平逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。  
2.4反油酸对SH-SY5Y细胞自噬相关基因和蛋白表达的影响
        随着反油酸浓度的增加,与对照组比较,各组细胞自噬相关基因表达水平差异均无统计学意义(P>0.05);50和100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见图5~6    
3讨论
        目前国内外研究暂缺乏对于TFAs与SH-SY5Y细胞的毒性剂量-反应关系研究,而据文献报道,TFAs与人成熟脂肪细胞[8]、血管内皮细胞[9]、HepG2细胞[10]、细胞活力及功能研究中表明,100 μmol/L的反油酸可以引起细胞产生毒性作用。本研究采用CCK-8法检测细胞活力,发现 100 μmol/L的反油酸能够引起细胞活力下降,因此,确定选用100 μmol/L作为高剂量。本研究结果表明,加入50和100 μmol/L的反油酸后,细胞活力下降,细胞内出现自噬小体;100 μmol/L反油酸作用24和48 h后,细胞活力均明显降低;反油酸可使胞浆内cyt-c蛋白表达水平增高,50和100 μmol/L的反油酸可使LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐升高。    
图4反油酸对SH-SY5Y细胞线粒体和细胞浆cyt-c蛋白表达的影响(n=3)
     Figure 4Effect of elaidic acid on the expression of cyt-c proteins in mitochondria and cytoplasm of SH-SY5Y cells 
 注:A为线粒体内和细胞浆中cyt-c蛋白及相应内参照的western blot条带,图中VDAC1为线粒体内cyt-c蛋白内参照,β-actin  为胞浆中cyt-c蛋白内参照;B为线粒体内和细胞浆中cyt-c蛋白表达平均光密度值与相应内参照平均光密度值的比值柱形图;
     *表示与对照组比较,P<0.05;**表示与对照组比较,P<0.01;***表示与对照组比较,P<0.001;#表示与10 μmol/L   组比较,P<0.05;##表示与10 μmol/L组比较,P<0.01  
注:A为LC3B、Beclin1基因与内参照mRNA水平表达比值的柱形图;B为p62、atg5和atg12基因与内参照mRNA水平表达比值的柱形图
     图5反油酸对SH-SY5Y细胞LC3B、Beclin1、p62、atg5和atg12基因mRNA表达的影响(n=3)
     Figure 5Effect of elaidic acid on LC3B, Beclin1, p62, atg5 and atg12 mRNA expression in SH-SY5Y cells    
注:A为LC3B和Beclin1蛋白及内参照的western blot条带;B为LC3B和Beclin1蛋白表达平均光密度值与内参照平均光密度值的比值
     柱形图;*表示与对照组比较,P<0.05;**表示与对照组比较,P<0.01;#表示与10 μmol/L组比较,P<0.05
     图6反油酸对SH-SY5Y细胞LC3B和Beclin1蛋白表达的影响(n=3)
     Figure 6Effect of elaidic acid on LC3B and Beclin1 proteins expression in SH-SY5Y cells          
        研究[11]发现,TFAs通过影响铺展、黏附及细胞膜成分等方面降低细胞的存活率,生长抑制率与反油酸浓度和作用时间呈正相关[12],其改变细胞膜的流动性,进而影响细胞膜受体的响应,加重脑神经细胞氧化损伤水平[13],引起脑神经细胞内质网应激-线粒体损伤,从而影响细胞的生命活动[10]。TFAs将阻碍必需脂肪酸和胆固醇等脂质在细胞内的正常代谢[14],TFAs对细胞表现出了明显的细胞毒性[15]。本研究结果提示,反油酸表现出明显的细胞毒性,随反油酸浓度升高,细胞间隙增大,细胞内形成自噬小体;50和100 μmol/L的反油酸可明显降低细胞活力。
        自噬,即自体吞噬,是指溶酶体降解利用细胞内物质成分的过程。一些情况下,自噬促进细胞死亡,导致或促进疾病的发展进程[16]。研究[17]显示,在细胞进行自噬时自噬小体将增多,自噬小体增多可视为细胞自噬水平提高的表现。研究[18]表明,当发生神经退行性疾病时,细胞将发生自噬,如创伤性脑损伤后有明显的自噬发生。同时有研究[19]表明,发生神经退行性疾病时神经细胞和星形胶质细胞内自噬相关分子Beclin1表达明显上调;在对肌萎缩性脊髓侧索硬化症模型小鼠的研究[20]中发现,在症状出现前阶段神经细胞有明显的自噬增加,运动神经细胞胞体有明显自噬改变。另一项研究[21]证明,在肌萎缩性脊髓侧索硬化症症状出现阶段自噬小体增多。由此可见,在神经退行性疾病发生时,常伴有非正常的细胞自噬。
        Beclin1、LC3B作为自噬检测的标志性蛋白,其主要定位在细胞浆及一部分细胞核内部,其表达情况反映了胞内自噬体的数量[22]。LC3B因子的主要作用是控制自噬体的形成,自噬体经进一步引导与溶酶体结合后进行完全自噬[23],细胞进行自噬时LC3B的蛋白表达量将增加[24],其含量与自噬泡数量呈正比,是自噬研究中最明显、最常用的标志物[25]。Beclin1基因位于人类染色体17q21上,是哺乳动物参与自噬的特异性基因。目前的研究[26-27]表明,Beclin1基因参与细胞自噬和细胞凋亡过程,是自噬小体形成的关键分子。本研究结果表明反油酸上调LC3B和Beclin1蛋白的表达水平,表现出促进细胞自噬的作用。
        Beclin1蛋白作为各种调控通路的汇集点发挥了至关重要的作用,可以影响线粒体膜的通透性,促进线粒体cyt-c蛋白的释放。cyt-c蛋白是一种水溶性蛋白,主要存在于线粒体内外膜间隙中,线粒体cyt-c蛋白是控制细胞凋亡发生的阀门,它具有调控细胞能量代谢和凋亡的双重功能,直接介导细胞凋亡[28]。本研究中,随着加入反油酸的剂量逐渐增加,与对照组比较,线粒体内cyt-c蛋白水平表达逐渐降低,而细胞浆中cyt-c蛋白表达水平逐渐升高,提示反油酸引起了cyt-c蛋白从线粒体释放到细胞浆中,最终导致了细胞凋亡。
        综上所述,本研究结果表明反油酸可使SH-SY5Y细胞活力下降,导致LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐增加,提高线粒体膜的通透性,使线粒体cyt-c蛋白释放到胞浆中的浓度增高,最终导致细胞凋亡。本研究探讨了TFAs对SH-SY5Y细胞的毒性作用机制,为研究神经退行性疾病的发生发展提供了依据。
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