克罗诺杆菌(Cronobacter)属于肠杆菌科，是一种兼性厌氧、有动力、无芽孢的革兰阴性条件致病菌。该菌广泛分布于包括婴儿配方粉、奶制品、鸡蛋、水果等食品及土壤、水、尘土等自然环境中^［1-2］，以婴儿配方粉、婴儿谷物食品等最常见，新生儿克罗诺杆菌感染的主要途径为食用因加工、储藏或者冲调不当导致污染的婴儿配方粉，该菌对免疫力低下的新生儿和早产儿可引起脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎，死亡率高达40%～80%^［3-4］。近年来报道^［5-6］显示，相较于婴儿感染者，免疫力缺陷的成人（主要是老年人）被克罗诺杆菌感染的情况更为常见，与新生儿感染不同，成人克罗诺杆菌感染主要症状为菌血症、骨髓炎、脾脓肿、肺炎、结膜炎、伤口感染和尿路感染。目前研究^［7-8］发现，菌株序列型（sequence types, STs）与克罗诺杆菌感染存在一定关联，导致新生儿脑膜炎的克罗诺杆菌均为ST4型，而ST7型多与成人感染相关，ST8型虽然与临床病例相关，但并不一定导致新生儿感染。
        脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electro-phoreses, PFGE）是分子生物学分型的“金标准”，广泛应用于病原菌基因组特征分析和不同来源菌株间的遗传相关性研究。克罗诺杆菌的多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）方法主要通过atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和pps七个管家基因的序列差异，通过与网络数据库比对获得菌株ST型。本研究对全国19个省/自治区/直辖市婴儿配方粉来源的49株克罗诺杆菌进行PFGE和MLST分型，探讨我国目前婴儿配方粉污染克罗诺杆菌的主要分子分型特征及流行株，分析不同地区间菌株亲缘相关性，为我国克罗诺杆菌引起的疾病溯源提供技术支持。             49株克罗诺杆菌分离自2012—2014年全国19个省/自治区/直辖市的婴儿配方粉样品，包括北京、福建、甘肃、广东、贵州、河北、河南、湖北、湖南、吉林、江西、内蒙古、宁夏、山东、山西、陕西、四川、新疆和云南。标准菌株为沙门菌(H9812)，由本实验室保藏。              PCR扩增仪（C1000）、凝胶成像系统（Gel Doc）、脉冲场凝胶电泳仪（CHEF-mapper）均购自美国Bio-Rad，比浊仪（法国生物梅里埃），超纯水仪，生化培养箱，电子天平。
        Tris base、Tris-HCl、2×GoTaq Green Master Mix均购自美国Promega，细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），脑心浸液琼脂（BHA，北京陆桥技术有限公司），蛋白酶K（德国Merek），限制性内切酶XbaⅠ、SpeⅠ均购自美国New England BioLabs，十二烷基磺酸钠、SeaKem Gold（SKG）琼脂糖均购自美国BD。              将于-70 ℃冰箱中冻存的49株克罗诺杆菌和参考菌株（H9812）划线接种于BHA上，37 ℃培养24 h，挑取单克隆再次接种BHA培养基，37 ℃培养18 h。              用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，7对管家基因序列扩增引物来自PubMLST网站，引物序列如表1所示。PCR反应体系（50 μl）：2×buffer 25 μl，上下游引物（10 μmol/L）各2 μl，样品DNA 2 μl，ddH₂O 19 μl。PCR反应条件：96 ℃预变性1 min，96 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30个循环，72 ℃延伸5 min。PCR产物由上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果提交PubMLST获得菌株ST型。 
        用无菌棉签刮取新鲜菌落，于3 ml无菌细胞悬浮液（100 mmol/L Tris-HCl，100 ml乙二胺四乙酸，pH=8.0）中制成4.0～4.5麦氏浓度菌悬液；取400 μl菌悬液至1.5 ml EP管中，37 ℃水浴5 min，加入20 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K；加入400 μl的1%SKG琼脂糖，混匀，制作胶块；将制作好的胶块放入50 ml离心管中，加入5 ml细胞裂解液（50 mmol/L Tris，50 nmol/L乙二胺四乙酸，1%十二烷基肌氨钠，pH=8.0）和25 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，55 ℃恒温水浴170 r/min振荡孵育2 h，弃去管内液体；无菌蒸馏水50 ℃清洗2次，每次10 ml；预热的TE缓冲液50 ℃清洗3次，每次10 ml；清洗后的胶块置于5 ml TE内4 ℃保存。胶块用XbaⅠ、SpeⅠ两种酶切37 ℃水浴2 h后电泳。电泳条件：电泳凝胶1%SKG琼脂糖、2.2 L 0.5×TBE电泳液，温度14 ℃，电场强度6 V/cm，电厂角度120°，脉冲时间2.16～63.8 s，电泳条带30～700 kb，电泳时间18 h。电泳结束后，用GelRed染色30 min，清水脱洗2次；图像应用BioNumerics V7.6数据库软件进行处理。           本研究对49株克罗诺杆菌进行MLST分型鉴定，将7个管家基因测序所得结果拼接校正后上传PubMLST网站，获得等位基因数值并得到相应的菌株ST型。49株菌株共有15个已知ST型和2个新ST型，ST4、ST1和ST64为常见型别，其中ST4型共10株，占全部菌株的20.4%（10/49）。ST1型共9株，占全部菌株的18.4%（9/49）。ST64型共5株，占全部菌株的10.2%（5/49）。通过将测序结果提交PubMLST网站，2个新发现的ST型被网站收录后命名为ST645和ST646，其他ST型比较分散，见图1。
        全部49株克罗诺杆菌进行PFGE分型，将Xba Ⅰ、SpeⅠ两种酶切的结果用BioNumerics V7.6进行合并分析。PFGE图谱中相似度大于85.0%的菌株可以判断为具有流行病学相关性^［9］，通过分析，本研究共有38种不同的分型，分别为1～38型，详见图2。其中8型(12287、12288、12286)分为2个亚型，8A型包括2株菌（12287、12288），菌株相似度为100.0%，亚型间相似度为87.0%；22型（14019、14020、13225）分为2个亚型，亚型间相似度为86.0%，其中22A型包括2株菌（14019、14020），菌株相似度为100.0%；27型（13125、13124、13114）分为2个亚型，亚型间相似度为93.5%，其中27A型包括2株菌（13125、13124），菌株间相似度为100.0%；32型（12150、12151）分为2个亚型，亚型间相似度为89.0%；35型（12189、12190）也分为2个亚型，亚型间相似度为91.0%。9型（12158、12165）、11型（12161、12246）和19型（13196、12232） 各有2株菌，菌株间相似度为100.0%；其余各型仅包括1株菌。                  本研究利用PFGE从DNA水平对49株克罗诺杆菌菌株进行分子分型，通过比较DNA指纹图谱的相似性获得菌株亲缘关系，共发现38个带型，大多数带型间的相似度低于80.0%，未呈现出较高的相似度，也未发现有明显的优势分型与聚集现象，表明19个地区来源于婴儿配方粉的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性，据此可以预测我国婴儿配方粉污染克罗诺杆菌导致婴儿患病以散发为主，出现多人患病的暴发事件几率较低。
        本研究的49株克罗诺杆菌中ST4型有10株，占全部菌株的20.4%，是婴儿配方粉分离株中的主要型别，克罗诺杆菌ST4型与新生儿脑膜炎相关，有报道^［7］ST4型相较ST1、ST8、ST12、ST21、ST64和ST201型的菌株有更强的耐干燥能力，这可能与ST4型成为婴儿配方粉中被发现的主要型别密切相关，表明污染ST4型菌株的婴儿配方食品对婴幼儿有潜在的风险。本研究ST1型有9株，占全部菌株的18.4%，也是婴儿配方粉中分离的主要型别之一，这与SONBOL等^［10］的报道相同，同时HIMELRIGHT等^［11］报道过ST1型可能与新生儿脑膜炎相关。ST12型3株，占全部菌株的6.1%，该型可感染新生儿并导致婴儿患坏死性小肠结肠炎。在全部17个型别中，ST266型与ST4型仅infB基因存在差异，而其中一个新发现的ST645型与ST1型仅gyrB基因存在差异。MLST分型的作用不仅仅局限于鉴定和基因分型，同时也反映了新生儿感染的潜在临床意义，并能精准追踪和溯源。
        PFGE和MLST结果结合分析表明，具有相同的PFGE型的菌株也有相同的MLST型，而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系，这与MLST是针对7个高度保守的管家基因的多态性进行分析，而PFGE是基于细菌基因组DNA进行比较因此具有更高的多态性和分辨率有关。本研究利用PFGE和MLST分型技术对我国19个地区婴儿配方粉来源的克罗诺杆菌进行研究和分析，初步显示了菌株的基因多态性，基于目前的结果，尚需分析更多的菌株才能得出我国目前婴儿配方粉污染克罗诺杆菌的主要分子分型特征及流行株，预测克罗诺杆菌可能带来的食品安全风险。