诺如病毒（Norovirus，NoV）归属于杯状病毒科诺如病毒属，根据其基因组同源性特征可分为GI～GVI 6个基因组。其中GI和GII较常见，是引起人类急性胃肠炎的2个主要基因组^［1］。该病毒流行区域广泛，以肠道传播为主，主要通过污染水源、食物以及环境接触等方式在人群中传播，具有传染性强和传播能力快等特点^［2］。据世界卫生组织（WHO）报道^［3］，全球每年因NoV感染造成6.86亿腹泻病例和约21万死亡病例，其中85%的腹泻病例及99%的死亡病例发生在发展中国家，是目前全球公认的非细菌性急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要病原^［4-5］。2015年WHO首次发布全球食源性疾病负担的评估，确定NoV为全球引起食源性疾病的主要病原，也是引起食源性疾病死亡五大致病因子之一^［6］。
目前，国内外对NoV感染研究主要集中在人群的暴发疫情监测调查，而对非聚集性食源性散发病例开展的流行病学研究相对较少^［2,7-8］。本研究选取2014—2016年济南市2家医疗机构作为哨点医院，对食源性散发腹泻病例开展连续监测，旨在了解食源性NoV感染的流行病学特征和临床特点，明确济南市食源性NoV感染的基因型别和流行规律，为今后的科学防控提供依据。            本研究综合考虑实验室检测能力和地域代表性以及可操作性，选取济南市综合性医院和儿童医院各1家医疗机构作为哨点医院，负责病例筛选、信息收集和标本采集。济南市疾病预防控制中心负责NoV检测和复核。              食源性散发腹泻病例：本研究仅对就诊病例进行筛选，符合以下3个条件，即可纳入食源性散发腹 泻病例：①患者主诉或门诊医生认为由食品或怀疑 由食品引起的，以腹泻症状为主的就诊病例；②腹泻是指24 h内排便3次或3次以上，且粪便性状异常，如稀便、水样便、粘液便或脓血便等；③排除暴发病例，仅纳入呈散发状态的腹泻病例，即在发病时间及地点上腹泻病例之间无相关性和聚集性。
        NoV阳性病例：符合食源性散发腹泻病例的3个条件，且粪便标本经NoV核酸检测为阳性，即判定为NoV阳性病例。              哨点医院负责病例的筛选和病例人口学信息（性别、年龄、职业、住址）、临床信息（发病日期、就诊日期、症状、餐饮情况等）的收集。哨点医院负责粪便标本采集。使用无菌采样杯采集病例约5 g粪便标本，放置于清洁、干燥、无吸水性的无菌密闭容器内，30 min内保存于-20 ℃冰箱中，由专人负责用冷藏箱（配备冰袋）运送至实验室检测。             Agilent Mx3005P实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）仪、涡流混合器均购自美国安捷伦。检测GI、GII组诺如病毒核酸试剂盒（山东艾克韦生物技术有限公司），具体操作均按试剂盒说明书执行。              主要依据2014—2016年《国家食品微生物风险监测工作手册》。检测流程分为标本前处理、RNA提取、RT-PCR检测和基因测序分型等步骤。诺如病毒GI和GII基因组检测使用多重RT-PCR，扩增引物及其PCR产物信息见表1。              每次RT-PCR试验都应设置阴性对照和阳性对照，阳性对照为阳性粪便标本或标准品。扩增循环阈值（cycle threshold，CT）≤35，则判定检测标本NoV阳性；CT值≥45，则判定检测标本NoV阴性；当35＜CT值＜45，重新测试，重测样品CT值＜45，则判定检测标本NoV阳性，CT值≥45，则判定检测样本NoV阴性。
        采用Excel 2007软件建立数据库，整合流行病学信息和实验室检测结果，运用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析。率或占比的比较用χ2或Fisher确切概率值检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。             2014—2016年共采集1 292例食源性散发腹泻病例的粪便标本，其中240例检出NoV阳性基因，阳性率为18.58%（240/1 292），其中GI基因型阳性病例52例，GII型阳性病例181例，GI、GII混合型病例7例，阳性率分别为4.02%（52/1 292）、14.01%（181/1 292）、0.54%（7/1 292）。GII基因型 在NoV阳性病例中的占比 （75.42%，181/240）高于GI基因型（21.67%，52/240）。             240例NoV阳性病例中，男性130例，女性110例，性别比为1.18∶1。经χ2检验统计分析，不同性别的NoV病例以及GI和GII基因型病例阳性 率差异均无统计学意义（χ2＝0.840，P＞0.05；χ2＝3.495，P＞0.05；χ2＝0.001，P＞0.05）。NoV阳性病例在各年龄段均有检出，最小年龄为8天，最大年龄为84岁，以1岁以下年龄段阳性病例最多，占31.67%（76/240）。各年龄段间NoV阳性率差异有统计学意义（χ2＝78.11，P＜0.001）。5岁以下年龄段GI基因型阳性率较低，而5岁以下年龄段GII基因型阳性率较高，GI、GII两种基因型在各年龄段的阳性率差异均有统计学意义（χ2＝27.680，P＜0.001；χ2＝48.777，P＜0.001），见表2。GI、GII混合型病例分布情况为2014、2015、2016年分别为1、2、4例，男、女分别为4、3例，0～5、18～35、36～59岁分别为1、4、2例。             2015年检出NoV阳性病例数最多，共114例，占47.50%（114/240）。NoV以及GI基因型病例阳性率均以2015年最高，且不同年度间差异均有统计学意义（χ2＝21.895，P＜0.001；χ2＝54.518，P＜0.001），而GII基因型病例阳性率在不同年度间差异无统计学意义（χ2＝2.322，P＞0.05），见表2。
     2014—2016年第一至第四季度NoV阳性率分别为63.64%（14/22）、19.88%（66/332）、10.86%（63/580）、27.09%（97/358），以第一与第四季度NoV阳性率高，且各季节间NoV阳性率差异有统计学意义（χ2＝69.90，P＜0.001），说明食源性NoV感染在春冬季较为流行。第一至第四季度GII基因型病例占比分别为92.86%（13/14）、66.67%（44/66）、65.08%（41/63）、85.57%（83/97），均高于GI基因型，且不同季度间2种基因型所占比例差异有统计学意义（χ2＝11.44，P＜0.05），即GII基因型为济南市全年食源性NoV感染的主要类型，在第一和第四季度尤为明显。见图1。
        240例食源性NoV阳性病例中，具有呕吐、腹 痛、发热症状的病例分别为72、54和23例，其占比分别为30.00%（72/240）、22.50%（54/240）和9.58%（23/240）。除腹泻外，呕吐、发热、腹痛3种症状是食源性NoV感染病例的主要临床症 状。从8种临床症状构成情况看，单纯腹泻症状 在NoV病例以及GI、GII基因型病例中占比最高，分 别为54.17%（130/240）、34.62%（18/52）和60.77%（110/181）；腹泻+呕吐症状在NoV病例和GII基因型病例中列第2位，占比分别为18.75%（45/240）和19.89%（36/181）。腹泻+腹痛症状在GI基因型病例中列第2位，占26.92%（14/52）。从8种临床症状病例阳性率情况看，NoV病例以及GI、GII基因型病例中均以腹泻+呕吐+发热症状最高，阳性率分别为46.15%（6/13）、7.69%（1/13）和38.46%（5/13）。经统计学检验，NoV病例以及GII基因型病例各临床症状阳性率差异有统计学意义（χ2＝36.468，P＜0.001；χ2＝56.630，P＜0.001），GI基因型病例各临床症状阳性率差异无统计学意义（χ2＝6.448，P＞0.05），见表3。
         240例NoV病例中平均腹泻频次为5.82次/d，以5～6次/d的中度腹泻为主，占38.75%（93/240），其次为7次/d及以上重度腹泻者，占33.33%（80/240）。GI和GII基因型NoV病例腹泻频次有所不同，GI基因型以3～4次/d的轻度腹泻为主，GII基因型以5~6次/d的中度腹泻为主。经χ2检验，GI和GII基因型病例腹泻次数之间差异有统计学意义（χ2＝15.63，P＜0.001）。NoV病例以及GI和GII基因型病例的粪便性状均以水样便为主，所占比例均在90%以上。经χ2检验，GI和GII基因型病例粪便性状之间差异无统计学意义（χ2＝2.412，P＞0.05）。NoV病例以及GI和GII基因型病例中出现呕吐症状的比例约占30%，有呕吐症状的病例中， 呕吐频次以1～2次/d居多。经χ2检验，GI和GII型病例呕吐频次之间差异无统计学意义（χ2＝0.698，P＞0.05），见表4。              NoV感染病例中可疑暴露食物种类以肉及肉制品所占比例最高，其次为水产动物及其制品和乳及乳制品，占比分别为20.00%（48/240）、18.33%（44/240）和15.00%（36/240）。其中GI基因型以水产动物及其制品占比（25.00%，13/52）最高，GII基因型以乳及乳制品占比（19.89%，36/181）最高，2种基因型可疑暴露食物所占比例之间差异有统计学意义（χ2＝33.06，P＜0.001），见表5。可疑暴露食物种类阳性率列前3位的是蛋及蛋制品、饮料与冷冻饮品类食品和其他食品，阳性率分别为30.65%（19/62）、25.00%（5/20）、25.00%（5/20），其中GI基因型多暴露于饮料与冷冻饮品类食品，GII基因型多暴露于蛋及蛋制品。             NoV是导致食源性疾病最常见的病原体之一^［6］。由于NoV具有高度传染性和快速传播能力，且感染剂量低，自然感染后缺乏持久免疫力，具有多种传播途径，极易发生暴发疫情，并与其他病毒感染存在临床表现相似性，故对散发病例进行病原学检测及流行病学特征分析对NoV的疾病监测和疫情控制尤为重要^［10］。
        本研究结果显示，2014年1月—2016年12月济南市食源性散发腹泻病例中，NoV阳性率为18.58%，高于嘉兴市^［11］（10.57%）及新疆^［12］
     （7.16%）食源性NoV散发感染的检出率，低于杭州市^［13］急性胃肠炎感染中NoV的检出率（26.87%），与黎健等^［14］对上海市腹泻病例中的NoV检出率（13.58%）接近。GII基因型阳性率为14.01%，占NoV感染的75.42%，即济南市食源性NoV感染的主要类型是GII基因型，与既往NoV引起食源性腹泻病例、感染性胃肠炎暴发及散发腹泻病例的常见基因型一致［2,12,15-16］。本研究发现NoV病例以及GI和GII基因型病例阳性率不存在性别差异，与以往研究^［17］一致。本研究显示各年龄组NoV阳性率均高于12%，5岁以下年龄组的NoV阳性率较高，且高于陈惠芳等^［16］和姚玮蕾等^［18］的报道，提示婴幼儿为济南市食源性散发腹泻病例NoV的易感人群，但本研究中由食物导致的诺如病毒阳性病例均为患者自述或医生诊断，所以不排除接触、经水传播等其他传播方式，尤其是1岁以下婴儿，需在以后研究中进行现场调查，从而得到验证。
        据报道^［7］，NoV感染及暴发与季节有较大联系，容易受到外界环境的影响，如温度、光照度、阳光辐射、土壤盐分等。本研究发现4个季度阳性率之间差异有统计学意义（P＜0.05），且第一与第四季度NoV感染阳性率均较高，说明济南市食源性NoV感染在春冬季较为流行。其中GII基因型为济南市全年食源性NoV感染的主要类型，并在第一和第四季度尤为明显，这与干冷季节适合病毒生存有关^［14］。散发腹泻全年均有发生，高发季节是冬春季^［19-20］，提示在第一和第四季度应加强针对食源性NoV感染的防控。
        本研究发现，除腹泻外，呕吐、腹痛、发热症状是食源性NoV感染病例的3种主要特征，与以往研究^［21-22］相似。从8种临床症状病例阳性率情况看，NoV阳性病例中以腹泻+呕吐+发热症状为主（46.15%），其次为腹泻+呕吐（25.42%）和单纯腹泻（22.26%）病例。虽然腹泻+呕吐+发热症状病例阳性率最高，但该症状群标本数量偏少，其总检测例数的占比仅为1%，阳性例数占比也不足3%。标本数量少易产生统计偏倚，导致检验效能偏低，夸大了各症状群间统计结果的差异，可能过高地估计了腹泻+呕吐+发热症状群的效果，易对食源性NoV病例临床特征的真实性和可靠性结果的判定产生影响，有待扩大标本数量进一步修订完善。
        NoV阳性病例以中度腹泻为主，GI基因型以轻度腹泻为主，GII基因型以中度腹泻为主，通过临床症状，对于病原体有一定的提示作用；且GII基因型是引起食源性疾病暴发的常见基因型^［8］，因此根据腹泻的程度可以初步判定NoV感染的类型，从而提示预防NoV暴发。NoV阳性病例以及GI和GII基因型病例均以无呕吐和水样便为主要临床表现，其也是GI和GII基因型NoV感染腹泻的共同特征。
        食源性NoV阳性病例中可疑暴露食物种类以肉与肉制品所占比例最高，其次为水产动物及其制品和乳与乳制品，占比分别为20.00%、18.33%和15.00%，与常见引起NoV食源性疾病的食物种类一致^［8,23］。可疑暴露食物种类阳性率列前3位的是蛋及蛋制品（30.65%）、饮料与冷冻饮品类食品（25.00%）和其他食品（25.00%），其中饮料与冷冻饮品类食品和其他食品的检验标本数量偏少，可能过高的估计其阳性率，有待扩大标本数量进一步研究。GI与GII基因型可疑暴露食物种类有所不同，提示不同的食物暴露的感染类型有所不同。
        本研究对食源性散发腹泻病例NoV感染连续监测，并对不同病原类型的流行病学特征及临床特征进行全面分析，并进行临床症状、暴露食物种类的不确定性分析，从而能够较好地反映食源性散发腹泻病例NoV感染的情况。但本研究存在一定局限性，首先仅在济南市2个哨点医院开展监测，其代表性可能不足；其次，哨点医院第一季度采集标本数量明显较少；收集的可疑暴露食品信息仅是病例的回忆，准确性及关联性存在偏差；临床上诊断的食源性腹泻病例与流行病学诊断存在不同。
本研究表明济南市食源性散发腹泻病例NoV以GII基因型为主，具有明显的季节性，婴幼儿为易感人群，同时单纯腹泻及腹泻+呕吐症状是食源性散发NoV感染病例的主要临床表现，其中GI基因型以轻度腹泻为主，GII基因型以中度腹泻为主；不同型别之间可疑暴露食品有所不同。故应针对性的加强监测和防治，特别通过对散发NoV病例的监测提高食源性疾病的暴发识别及防控。