酵米面类食物中毒是迄今为止在我国发现的一种病死率极高的微生物类食物中毒。该中毒多发生于边远贫困地区，具有地域性特点，由于其中毒发病急、难治愈、死亡率高，给消费者生命健康造成了严重危害。因此，开展酵米面类食物中毒的病原学分析，特别是明确该病原菌的分类地位和命名，对于预防此类公共卫生事件具有重要意义^［1］。    2014年6月21日云南省文山州广南县某居民户自制吊浆粑，当天食用后无不适，剩余吊浆粑在室内存放，分别在27日加工成汤圆油炸和煮食后供23名村民用餐。进食者为20人，其中一人食用5个汤圆，于20 min后出现了恶心和呕吐症状，潜伏期最长者食用了半个汤圆，于38 h后感觉恶心。食用者均中毒，无性别、年龄差异，主要临床表现为恶心（4/20）、呕吐（11/20）、头晕（5/20）、腹痛（6/20）、腹泻（1/20）、乏力（4/20）、意识模糊（1/20）、昏迷（6/20），重症病例表现出头晕、意识模糊、昏迷，伴全身多器官损伤，而未进食吊浆粑者和仅喝汤者无临床症状。给予催吐、保肝、解毒等治疗后，重症患者转入ICU，并给予血浆置换、重要器官保护、抗感染等治疗。此次食物中毒事件死亡6人，死者分别为5、43、84岁男性和18、43、50岁女性，死亡诊断为多脏器功能衰竭。其他患者陆续出院，预后良好。引起食物中毒的吊浆粑制作流程为：玉米浸泡15 d，期间3～5 d换一次水，之后进行碾碎、磨浆、吊滤，在太阳下晒干后常温存放。食用前揉捻成汤圆状，每个约重10 g，油炸或水煮食用。事件发生后，云南省文山州疾病预防控制中心将从食用户家中采集的剩余吊浆粑（干粉）、生汤圆、熟汤圆以及制作户剩余的吊浆粑，共4份样品送至云南省疾病预防控制中心，实验室参照GB/T 4789.29—2003《食品卫生微生物学检验 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》^［2］针对食源性致病菌进行菌株分离鉴定、毒素和米酵菌酸分析。
    雄性小鼠，SPF级，体质量18～20 g，由昆明医学院实验动物中心提供［动物合格证号：SCXK（滇）2011-0004］，饲料由昆明医学院实验动物中心提供［合格证号：SCXK（滇）2011-0005］。环境条件：温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%。
在食用户和制作户家中共采集4份样品，吊浆粑干粉、生吊浆粑、生汤圆和煮熟的汤圆各一份，每份约100 g，采集后2～8 ℃冷藏储运，3 h内运送到实验室开展检验。
         VITEK 2 COMPACT全自动细菌鉴定和药敏分析仪（法国梅里埃）、Cycler PCR仪（美国Bio-Rad）、凝胶图像分析系统（英国SYNGENE）、Agilent 1290超高效液相色谱仪（美国安捷伦）、液质联用仪AB3200 Q TRAP（美国AB SCIEX）、Nanopure 纯水机、匀浆机、大容量高速离心机、旋转蒸发仪。
GVC增菌液（椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用）、沙门菌志贺菌SS琼脂、卵黄琼脂平板、微量生化管均购自北京陆桥技术有限责任公司；进口PDA（马铃薯葡萄糖琼脂，英国OXOID），改良PDA（进口PDA使用时加入1/100 000龙胆紫、20 μg/ml氯霉素）；Premix Taq、DL2000 DNA Marker和核酸染料Goldview均购自日本TaKaRa；VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡（法国梅里埃）；琼脂糖（西班牙Biowest）；酵米面黄杆菌毒素标准品（B6179，美国Sigma）；PCR引物合成和产物测序均由苏州金唯智科技有限公司完成。
        样品用0.85%生理盐水按1∶2的比例稀释成浓悬液，用无菌接种环取一环悬液在PDA平板和改良PDA平板直接分离纯化，同时参照GB/T 4789.29—2003^［2］将样品用GVC增菌液增菌后，PDA平板和改良PDA平板分离纯化和革兰染色。用微量生化管结合VITEK 2 COMPACT对分离株进行生化鉴定。
        LB平板划线培养分离株，30 ℃培养24 h。挑取单菌落，加入装有50 μl无菌去离子水的PCR管中，混匀，98 ℃裂解10 min，12 000 r/min离心5 min，收集上清液即细菌DNA，4 ℃保存备用。用16S rRNA通用引物27-F（AGAGTTTGATCCTGG CTCAG）和1492-R（GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增。50 μl PCR体系：Premix Taq酶25 μl，引物各2 μl，DNA模板5 μl，无菌MiliQ水16 μl。PCR条件为：94 ℃裂解5 min；94 ℃变性50 s，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸90 s，循环30次；72 ℃ 延伸5 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离，Goldview染色，凝胶成像分析仪观察PCR扩增结果。PCR产物由苏州金唯智科技有限公司测序，结果经修正后提交GenBank并获得编号。用MEGA6.0软件采用邻近法基于16S rRNA序列进行聚类分析，构建进化树，经过1 000次数值分析Bootstrap为1 000。
        小鼠毒性试验参照GB/T 4789.29—2003 方法进行^［2］。每份样品采用3只小鼠，每只取0.5 ml 粗毒素进行灌胃，7 d内观察受试动物反应和死亡情况。
        采用液相色谱-质谱联用快速检测技术，按照GB/T 5009.189—2003《银耳中米酵菌酸的测定》^［3］进行米酵菌酸定量分析检测，检测数值参照GB 11675—2003《银耳卫生标准》^［4］中理化指标判断结果。
        4份样品除生汤圆外均分离出椰毒假单胞菌疑似菌株（YD-1、YD-2、YD-4），-70 ℃保藏并进行后续分析。3株菌均为革兰阴性短杆菌并具有一致的菌落特征：在PDA平板上（36±1） ℃培养24 h，菌落直径为1～1.5 mm，灰白色，表面光滑、湿润，菌落边缘整齐，48 h时菌落中心凸起，周围产黄绿色色素；在改良PDA平板上菌落为圆形，直径1～2 mm，深紫色，微凸，表面光滑、湿润，菌落边缘整齐，易于挑取；在卵黄琼脂平板上的菌落表面光滑、湿润，（36±1） ℃培养48 h后周围形成乳白色混浊环，斜射呈虹彩现象；在SS琼脂平板上不生长。
        挑取PDA上36 ℃培养24 h的少量纯菌，用微量生化管和GN鉴定卡进行生化鉴定，结果为动力+，氧化酶-，靛基质-，V.P-，O/F试验（O型）+，葡萄糖-，果糖-，半乳糖-，阿拉伯糖-，甘露醇+，硝酸盐还原+，尿素-，侧金盏花醇-，柠檬酸盐利用+，精氨酸+，5 ℃和41 ℃均不生长。用VITEK 2 COMPACT对3株菌进行系统生化鉴定，结果均为唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）。
2.316S rRNA序列分析结果
对伯克霍尔德属内90个种^［5］在Genbank数据库中进行16S rRNA序列比对，BLASTN的结果参见表1，分离的3株菌在1 396 bp长度范围内互相之间仅有一个bp的差异，在整个数据库中互相比对，其结果最为近似。用邻近法构建伯克霍尔德属进化树，虽然某些种的不同菌株在该进化树上位置有变动，但是YD-1、YD-2、YD-4的16S rRNA序列与唐菖蒲伯克霍尔德菌ATCC33664、OM1和PA11.1以及GenBank数据库中唯一登记为椰毒伯克霍尔德菌（B.cocovenenans）的LMG11626T在同一个进化分支上（见图1），该种与植物伯克霍尔德菌（B.plantarii）和范式伯克霍尔德菌（B.vandii）在进化上有明显差异。16S rRNA序列分析该3株菌均属于伯克霍尔德属，且与B.gladioli同源性最高。
        4份样品均进行毒性试验，试验组小鼠20 min后出现竖毛，躁动不安、行步蹒跚、瘫软、抽搐、呈角弓反张、呼吸急促等症状，2 h之内全部死亡；对照组小鼠7 d后仍然存活。
        采用液相色谱-质谱联用快速检测技术对样品进行检测，4份样品中均检出米酵菌酸，其中吊浆粑干粉样品中含量为1.73 mg/kg，已煮熟的汤圆样品中含量为3.08 mg/kg，生汤圆样品中含量为5.07 mg/kg，生吊浆粑样品中含量最高为9.67 mg/kg。参考GB 11675—2003^［4］，米酵菌酸含量必须≤0.25 mg/kg，而4份样品中米酵菌酸含量均远高于此标准。
        此次食物中毒事件中生汤圆样品未检出疑似菌株，但该样品的毒性试验符合米酵菌酸典型中毒症状，且米酵菌酸检出含量为5.07 mg/kg，高于吊浆粑干粉和熟汤圆中米酵菌酸的含量，由于吊浆粑干粉、生吊浆粑和煮熟的汤圆中均检出B.gladioli，因此推测生汤圆中应存在疑似菌株，未检出的原因主要可能是由于生汤圆样品中存有大量杂菌（初步判断为酵母菌），GVC增菌液对酵母菌的抑制作用较弱，干扰了目标菌的生长。
        实验室分离到的3株菌生化结果与椰毒假单胞菌酵米面亚种在葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖和侧金盏花醇不同，可能与不同中毒事件菌株的特异性有关。经VITEK 2 COMPACT鉴定均为B.gladioli，且16S rRNA序列分析该3株菌与B.gladioli同源性最高。2013年云南省红河州曾发生过吊浆粑引起的食物中毒事件^［7］，也是由B.gladioli引起，这两起事件共造成11人死亡，均给社会带来了极大影响，在经济上造成了重大损失，所以B.gladioli引起的食物中毒应引起有关部门的高度关注。
酵米面食物中毒事件在我国时有发生，国内文献曾多次报道其病原菌为椰毒假单胞菌酵米面亚种^［8-9］，但在国外文献资料及目前进口微生物鉴定设备数据库中均查不到此菌种名称。关于该菌的命名，很多学者认为应将其归类到伯克霍尔德菌属。焦振泉等^［10-12］对我国椰毒假单胞菌酵米面亚种分离株与伯克霍尔德菌属进行同源性研究，认为“椰毒假单胞菌应该属于伯克霍尔德菌属，且与
        B.gladioli和B.cocovenenans特别近源”，建议依据国际细菌系统发育委员会的原则，将引起食物中毒的椰毒假单胞菌酵米面亚种归入B.gladioli，命名为B.gladioli pv.cocovenenans，以便和其他植物病原菌株区分^［13］。2012年德国研究者Nadine等^［14］对印尼食物中毒事件中的B.gladioli分离株进行了全基因组测序（草图）分析，德国菌种保藏中心已将分离自印尼有毒椰子发酵食品的B.cocovenenans DSM11318标准株，更名为B.gladioli^［15］。云南近几年发生的两次酵米面中毒事件，从流行病学调查和实验室检测结果来看，与国内其他椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒比较符合，可能是国内与国际上命名不一致，用VITEK微生物鉴定仪鉴定结果为B.gladioli。因此，发生酵米面类食物中毒事件的检验过程中，检测人员应特别重视，以免造成漏检、误检。同时，我国学者也应尽快明确其分类地位，及时对国家标准进行修订，在命名上与国际接轨。