肠球菌中某些菌种可作为发酵剂和益生菌用于食品和药品生产中^［1］，但是近几十年来发现，肠球菌中的一些菌株是条件致病菌，其引起的食品安全问题已引起相关专家的关注。食品中污染的肠球菌由于其环境耐受力强，难以通过加工手段杀灭，会在食品中快速繁殖，引起食物中毒^［2］。更应注意的是，肠球菌是重要的耐药基因储存库，其携带的耐药基因可通过食物链传递给其他食源性致病菌^［3］。肠球菌属目前有50多个种，大部分肠球菌来源于人和动物的粪便，而少数菌种来源于非粪便基质，不同种肠球菌的生理、生化特性，乃至致病宿主和耐药特征均不同，因此准确了解肠球菌的种属分布，对于认知其流行趋势和遗传变异具有重要意义^［1,4］。然而，由于没有肠球菌种水平鉴定显色培养基，一些肠球菌种水平特征基因序列又极为相似，肠球菌种水平的快速鉴定一直是微生物检验的一个难点，阻碍了相关实验室对肠球菌种属分布和流行特征的深入认识^［4-5］。本研究对前期从北京市集贸市场环境和生鲜猪肉中分离的肠球菌开展种水平鉴定，评价不同鉴定方法的区分效果和准确性，分析不同种肠球菌的耐药分布，描述食品中不同种属肠球菌的耐药特征。
        2015年5月从北京市某集贸市场分离肠球菌86株，其中来源于地面涂抹样品、墙壁涂抹样品、污水样品和生鲜猪肉样品的肠球菌数量分别为29、14、21和22株^［2］，其药物敏感性检验方法和药敏特征参见文献［6］。质控菌株粪肠球菌（ATCC 29212）为本实验室保藏。
        PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统均购自美国Bio-Rad，VITEK 2 COMPACT 全自动细菌鉴定仪、VITEK革兰阳性细菌鉴定卡、API 20 Strep试剂条和VITEK 2 Densi CHEKTM Plus浊度仪均购自法国梅里埃，MALDI Biotyper（德国布鲁克）。脑心浸液琼脂（BHA）和血琼脂平板均购自北京陆桥技术有限责任公司，2×Taq PCR MaterMix（KT201-02，北京天根生化有限公司）。         对86株肠球菌开展基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）质谱鉴定和VITEK 2 COMPACT生化鉴定，鉴定结果不一致的菌株，再分别开展API 20 Strep试剂条手工鉴定、16S rRNA和23S rRNA分子鉴定。MALDI-TOF-MS、VITEK 2 COMPACT革兰阳性细菌鉴定和API 20 Strep试剂条的使用方法按说明书进行。
        模板制备：用无菌接种环挑取BHA平板上培养的肠球菌菌苔，在200 μl无菌超纯水中混匀，加入5 μl玻璃珠涡旋振荡5 min后，于100 ℃水浴中加热10 min，13 000 r/min离心2 min，上清液即为制备好的DNA模板，将DNA模板转于另一无菌离心管中备用。引物合成：根据细菌高度保守的16S rRNA和23S rRNA^［7］序列分别设计引物27F/1492R和简并引物23F/23R，扩增片段长度分别为1.5 kb和400 bp。16S rRNA序列的引物信息为：27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3′；23S rRNA序列的引物信息为：23F:5′-GCGATTTCYGAAYGGGGRAACCC-3′（Y代表C或T，R代表A或G），23R:5′-TTCGCCT TTCCCTCACGGTACT-3′^［8］。PCR反应体系（50μl）：PCR Mix 25 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 22 μl，DNA模板1 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。16S rRNA和23S rRNA基因的测序结果使用美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的BLAST工具在数据库中进行序列比对，得分最高的比对结果认为是被检肠球菌所属菌种。
        按照美国临床和实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的微量肉汤稀释法^［9］，测定受试菌株对氨苄西林（AMP）、青霉素（PEN）、红霉素（ERY）、环丙沙星（CIP）、达托霉素（DAP）、万古霉素（VAN）、四环素（TET）、氯霉素（CHL）、高浓度庆大霉素（HLGR，250和500 μg/ml）和高浓度链霉素（HLSR， 500和1 000 μg/ml）等抗生素的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。并参照CLSI M100-S25^［9］文件表2D推荐的标准进行结果判定和解释。药敏质控菌株为粪肠球菌（ATCC 29212）。
        使用MALDI-TOF-MS和VITEK 2 COMPACT开展菌种鉴定的结果中，有70.9%（61/86）肠球菌的鉴定结果一致，25株鉴定结果不一致。对这25株菌分别使用API 20 Strep、16S rRNA和23S rRNA基因测序再次开展鉴定，鉴定结果如表1所示。在使用5种方法鉴定的25株菌中，1株菌（R16-C2）出现了4种不同鉴定结果，6株菌出现了3种不同鉴定结果，对这7株菌取鉴定一致结果，作为最终鉴定菌种。如表1所示，使用API 20 Strep开展种水平鉴定的结果中，28.0%(7/25)的鉴定结果分值低于80%，即结果可疑，需要附加试验进一步确认。16S rRNA和23S rRNA基因鉴定结果的符合率为92.0%（23/25），16S rRNA 鉴定W3-E1和R16-C2的结果分别为希拉肠球菌和泰国肠球菌，但23S rRNA鉴定结果是坚韧肠球菌和屎肠球菌。
MALDI-TOF-MS和VITEK 2 COMPACT鉴定D1-K1的结果分别为德氏肠球菌和棉子糖肠球菌，16S rRNA和23S rRNA分子鉴定结果为粪肠球菌，API 20 Strep鉴定结果疑似粪肠球菌，最终取粪肠球菌鉴定结果。
        根据鉴定结果，86株分离自北京市集贸市场环境和生鲜猪肉的肠球菌中，粪肠球菌占82.6%（71/86），希拉肠球菌占14.0%（12/86），屎肠球菌占1.2%（1/86），蒙氏肠球菌占1.2%（1/86），泰国肠球菌占1.2%（1/86）。北京市集贸市场地面涂抹样品来源的29株肠球菌中，粪肠球菌占89.7%（26/29），希拉肠球菌占10.3%（3/29）；墙壁涂抹样品来源的14株菌全部是粪肠球菌；污水样品来源的21株菌中，粪肠球菌占61.9%（13/21），希拉肠球菌占28.6%（6/21），屎肠球菌和蒙氏肠球菌各占4.8%（1/21）；生鲜猪肉样品来源的22株菌中，粪肠球菌占81.8%（18/22），希拉肠球菌占13.6%（3/22），泰国肠球菌占4.5%（1/22）。污水和生鲜猪肉中肠球菌种水平多样性高于墙壁和地面涂抹样品。
        在受试的10种抗生素中，71株粪肠球菌对TET、ERY、HLSR、CIP、HLGR和CHL的耐药率分别为69.0%（49/71）、52.1%（37/71）、35.2%（25/71）、29.6%（21/71）、26.8%（19/71）和22.5%（16/71）。所有受试粪肠球菌菌株对AMP、PEN、DAP和VAN均敏感，见表3。可以看出，TET抑制50%受试菌株生长所需抗生素浓度（MIC₅₀）＞32 μg/ml，已高于耐药折点，说明在10种受试抗生素中粪肠球菌对TET耐药最为严重。CIP、ERY、CHL、HLGR和HLSR抑制90%受试菌株生长所需抗生素浓度（MIC₉₀）均高于耐药折点，说明粪肠球菌对以上5种抗生素也已显示高耐药性。耐受3种及以上抗生素的菌株有26株，占所有受试粪肠球菌的36.6%（26/71），有8株粪肠球菌耐受6种抗生素，耐药谱为ERY-CIP-TET-CHL-HLGR-HLSR。12株希拉肠球菌对CHL、ERY、TET的耐药率分别为75.0%（9/12）、58.3%（7/12）和41.7%（5/12），对CIP、HLSR和HLGR的耐药率均为16.7%（2/12），见表4。另外，有1株分离自生鲜猪肉的希拉肠球菌对DAP耐药。12株希拉肠球菌中，33.3%（4/12）的菌株对3种及以上抗生素耐药，其中1株分离自地面涂抹样品的D2-C2对5种抗生素耐受，耐药谱为ERY-TET-CHL-HLGR-HLSR。         不同种属肠球菌的分布特点、致病宿主以及耐药特征有较大差异，因此了解不同基质中肠球菌的种属分布，对于研究耐药肠球菌的流行规律和传播途径具有重要意义。然而，传统肠球菌的种水平鉴定方法需要做一系列复杂的生理生化试验，难以满足高通量菌种鉴定的要求^［10］。国外常使用种特异PCR扩增和16S rRNA测序相结合对肠球菌开展种水平鉴定，但种特异PCR目前仅局限于几种常见肠球菌，且存在一定错误率^［4］，因此急需发展快速、准确、批量处理的种水平鉴定策略。本研究使用的5种肠球菌种水平鉴定方法各有优缺点。MALDI-TOF-MS适合于高通量菌种鉴定，速度快、耗材少、准确性较高^［5］，但缺点是仪器昂贵、维护费用高，不适合在基层单位推广。VITEK 2 COMPACT鉴定自动化程度高，但用于肠球菌种水平鉴定准确性较低。本研究中，使用VITEK 2 COMPACT鉴定肠球菌的准确率仅为4.0%（1/25），与文献报道^［8,11］相似，这可能是由于VITEK 2 COMPACT是根据一套生化反应结果鉴定菌种，如果菌株在培养过程中生化特性发生改变，必然导致鉴定结果不同。API 20 Strep试剂条虽然鉴定结果准确，但菌种鉴定范围有限，只能用于粪肠球菌、屎肠球菌、铅黄肠球菌、坚韧肠球菌、鹑鸡肠球菌、鸟肠球菌等6种肠球菌的种鉴定，且手工操作复杂，有时还需做补充生化试验，在本研究中就出现了较多（28.0%，7/25）可疑鉴定结果。有文献^［8,12］报道，16S rRNA序列难以把粪肠球菌和屎肠球菌区分，应使用23S rRNA进行肠球菌种水平鉴定。但从本研究结果看，16S rRNA序列分析对肠球菌有准确的区分度；因此，优化的肠球菌种水平鉴定策略是，先用MALDI-TOF-MS和16S rRNA序列分析技术对肠球菌进行种鉴定，二者不一致的结果再使用其他方法进一步确认。北京市集贸市场生鲜猪肉源肠球菌中，粪肠球菌占绝对优势，其次是希拉肠球菌，只发现了1株屎肠球菌，这一结果和人与动物消化道、粪便、医院、食品分离肠球菌中，粪肠球菌和屎肠球菌是主要优势菌种的报道^［13-14］不符。2014年中国细菌耐药性监测网收集的6 891株肠球菌中，粪肠球菌和屎肠球菌分别占45.4%和48.1%，其他肠球菌占6.5%^［15］。但在美国环境水样品中，铅黄肠球菌占34%，粪肠球菌占25%，蒙氏肠球菌占15%，屎肠球菌仅占5%^［4］。这说明不同来源样品中肠球菌的种属分布特征不同。而且，本研究中来自污水和生鲜猪肉的肠球菌显示了种水平的多样性，这可能与市场环境开放，污水和生鲜猪肉污染途径多渠道有关。粪肠球菌对CIP、TET、HLSR和HLGR的耐药率均高于希拉肠球菌，但对ERY和CHL的耐药率均低于希拉肠球菌，尤其是对CHL的耐药率远低于希拉肠球菌。另外，在希拉肠球菌中还发现了1株对DAP耐药的肠球菌，是较为罕见的耐药表型，提示今后应加强关注希拉肠球菌耐药性。2014年中国细菌耐药性监测网统计数据显示，粪肠球菌对抗生素的耐药率明显低于屎肠球菌，但对CHL的耐药率高于屎肠球菌，粪肠球菌和屎肠球菌均对HLGR表现出较高耐药率^［15］。目前国内外对除粪肠球菌和屎肠球菌以外的肠球菌的耐药性研究较少，本研究中分离的蒙氏肠球菌和泰国肠球菌均未呈现较强耐药性。本研究评价和比较了肠球菌种水平快速鉴定方法，初步阐述了北京市集贸市场肠球菌种属分布特征，分析了不同种肠球菌的耐药特征，为控制食源性耐药肠球菌的产生和传播积累了基础数据和信息支持。