贵州省一起灰花纹鹅膏中毒事件调查

朱姝1，郭华1，周亚娟1，杨龙剑2，周贻兵1

(1贵州省疾病预防控制中心，贵阳 550000；2毕节市疾病预防控制中心，毕节 551700)

摘 要：目的 调查分析贵州省毕节市七星关区一起灰花纹鹅膏中毒事件，为贵州省蘑菇中毒事件调查处置提供经验借鉴。方法 对事件开展流行病学调查，对可疑野生蘑菇标本进行形态学、分子生物学鉴定和毒素检测。结果 本次事件共4人进食自采野蘑菇，3人死亡，死亡率75%。经流行病调查、可疑蘑菇实验室鉴定，确定为灰花纹鹅膏( Amanita fuliginea)引起的中毒事件，样品中检出α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽。结论 此次事件为村民误采食灰花纹鹅膏引起的中毒事件。

关键词：毒蘑菇；流行病学调查；灰花纹鹅膏

Investigation of a mushroom poisoning incident caused by Amanita fuliginea in Guizhou Province

Zhu Shu1, Guo Hua1, Zhou Yajuan1,Yang Longjian2, Zhou Yibing1

(1Guizhou Provincial Center for Disease Control and Prevention, Guiyang 550000, China; 2Bijie Center for Disease Control and Prevention, Bijie 551700, China; 3National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China)

Abstract：Objective To investigate an incident of Amanita fuliginea poisoning in Qixingguan District, Bijie, Guizhou Province, provide experience and reference for the investigation and disposal of poisonous mushroom poisoning in Guizhou Province. Method Epidemiological investigations, morphological and phylogenetic identification, and laboratory testing were taken to analyze the poisoning event. Result In this incident, a total of 4 people ate self-harvesting wild mushrooms, resulting in 3 deaths and a mortality rate of 75%.According to epidemiological, clinical, morphological and molecular biological evidence, this incident was confirmed to be Amanita fuliginea. Three kinds of toxins, include α-amanitin, β-amanitin and Phallacidin were detected in laboratory. Conclusion The poisoning incident was caused by the villagers mistakenly eating Amanita fuliginea.

Key words：Poisonous mushroom; investigation; Amanita fuliginea

贵州省森林覆盖面积较大，雨量充沛，为野生蘑菇的生长提供了丰富的资源，由于百姓辨识不清，导致全省因误采误食野生毒蘑菇引起的中毒事件频繁发生。2020年7月，毕节市七星关区发生一起因进食自采野蘑菇导致中毒的4名患者。由于病人告知医生和调查人员食用的为奶浆菌，且就诊时临床症状为腹泻、呕吐等胃肠道症状，导致医生错判病人为误食胃肠炎型毒蘑菇导致的中毒而错过最佳治疗时间，最终3人因多器官功能衰竭导致死亡。

1 资料与方法

1.1主要仪器和试剂

超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(U3000 -TSQ Quantum Ultra)：美国赛默飞世尔科技有限公司；涡旋混合器(MS3型)：德国IKA有限公司；超声波清洗机(HS 6150 T型)：天津恒奥科技有限公司；台式高速冷冻离心机(3-18K型)：德国Sigma公司；Milli-Q超纯水机：美国密理博有限公司。标准溶液：α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)、γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)、二羟基鬼笔毒肽(PHD)、羧基二羟基鬼笔毒肽(PCD)、羧基三羟基鬼笔毒肽(PSC)标准溶液浓度均为50μg/mL购自福州勤鹏生物科技有限公司。色谱纯甲醇：美国赛默飞世尔科技；优级纯氨水：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1流行病学调查

属地疾控中心开展流行病学调查，包括对中毒患者和接诊医生的访谈，了解可疑餐次、蘑菇来源、加工过程、发病情况，及中毒患者的主要临床表现、病程进展和治疗情况。由知情人(病家邻居张某)带领调查组到中毒患者采集野蘑菇山上采集蘑菇。

1.2.2标本采集与处理

对采集到的可疑野生蘑菇进行拍照，并在45℃条件下使用鼓风式烘箱烘干至恒重。部分样品在贵州省疾病预防控制中心做毒素检测，部分样品寄至中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所进行形态学和分子生物学鉴定。

1.2.3 蘑菇物种鉴定

形态学鉴定：主要包括子实体颜色、大小、形状、质地等宏观特征以及担孢子、担子、囊状体和菌丝等微观结构[1]。

分子生物学鉴定：通过DNA提取，对转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)序列进行扩增、测序。将所得的ITS序列与Genbank下载的序列[1]用Clustalx1.83进行比对，再用BioEdit 7.0.5.3进行手工校对。采用最大简约法构建系统发育树，使用PAUP* 4.0b10软件。

1.2.4毒素检测

样品检测参照文献[2]。

1.2.4.1检测条件

超高效液相色谱条件：BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm，Waters科技有限公司)，柱箱温度：35℃，流动相A：甲醇，流动相B：0.05%氨水水溶液；流速：0.25mL/min,进样体积：10μL。梯度洗脱程序：0min(流动相A：90%，流动相B：10%)，保持1min，线性梯度至9.5min(流动相A：100%，流动相B：90%)，保持1min，10.5min回至初始流动相比例。

质谱条件：电喷雾离子源正离子模式(ESI+),喷雾电压3600V,离子源温度：300℃，脱溶剂温度：330℃，鞘气(N2)：38 arbitrary units，辅助气(N2)：7 arbitrary units，碰撞气压力(Ar)：1.5mTorr，多反应监测(MRM)参数见表1。

表1  质谱参数

Table 1  Mass spectrometry parameters

*为定量离子

1.2.4.2样品前处理

称取103mg蘑菇干粉于50 mL聚丙烯刻度离心管中，加入40mL甲醇-水溶液(V/V，20:80)，涡旋混匀，超声提取30 min，10 000 r/min离心5 min(离心半径6cm)，转移提取液于100mL容量瓶中，再向离心管中加入40mL甲醇-水(V/V，20:80)溶液，重复提取一次，合并提取液，定容至100mL，摇匀后，过膜0.22 µm的微孔滤膜，进样分析。若浓度超过线性范围，进一步稀释后定量。蘑菇毒素出峰时间分别为β-鹅膏毒肽为4.47 min，α-鹅膏毒肽为5.82 min，γ-鹅膏毒肽为6.42min，羧基三羟基鬼笔毒肽为6.09min，羧基二羟基鬼笔毒肽为6.42min，二羟基鬼笔毒肽为8.17 min。

2 结果

2.1 基本情况

2020年7月18日15时杨某到家附近山中采集3种共500g左右野生蘑菇，回家途中偶遇邻居张某，将采集的野生蘑菇展示给张某并邀请其共进晚餐，张某拒绝。当日17时杨某将采集的野生蘑菇清洗后用猪油翻炒至熟加入土豆同煮，晚餐搭配米饭食用，就餐者共4人，为杨某、杨某妻子、杨某女儿和杨某二哥。19日3时杨某和杨某女儿出现呕吐、腹泻症状，6时杨某妻子也出现相似症状，三人于9时到市医院就诊，接诊医生根据病人自述食用的奶浆菌及临床症状，判断病人为胃肠炎型蘑菇中毒，对病人进行对症支持治疗。杨某二哥仅食用4块土豆，于19日11时出现轻微腹泻，由于症状轻当日未就诊。7月21日，杨某和杨某女儿病情加重，医院除对症支持治疗外，加以血液灌流、血浆置换和持续肾脏替代疗法(CRRT)。调查组流调过程中找到病家邻居张某，在其带领下到附近山上采到病家所食用的3种野生蘑菇(纬度为北纬N：27°35′22″，经度为东经E：105°19′27″，海拔1782米，以壳斗科为主的常绿阔叶林，气候属亚热带湿润性季风气候，年平均气温15℃左右，平均降雨量1000毫升左右)。

2.2临床症状及转归情况

病人在食用野生蘑菇10~18小时后陆续发病，症状主要为恶心、呕吐、腹痛、腹泻，呕吐物为胃内容物，大便为稀水样便，罹患率100%。19日就诊的3例病例当日生化指标显示，丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)均在正常范围，20日开始上升，22日、23日到达最高值。由于病情过重抢救无效，3例病例分别于7月23、25日，8月13日死亡。杨某二哥21日了解其他3人病情危重才至医院就诊，生化结果显示其ALT和AST略高于正常范围，经医院对症治疗，于7月31日痊愈出院。病人发病情况及生化指标见表1和表2。

表2  七星关区蘑菇中毒病例发病情况一览表

Table 2  List of incidence of mushroom poisoning cases in Qixingguan District

表3七星关区蘑菇中毒死亡病例主要脏器功能部分生化指标检验结果

Table 3 Results of biochemical indices of main organ function in mushroom poisoning cases in Qixingguan district

注： ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天门冬氨酸氨基转移酶；—表示未检测；7月20日和21日未对病例3做以上检测。

2.2 可疑蘑菇鉴定结果

2.2.1. 形态学鉴定结果：

子实体小型至中等大小(图1)，菌盖直径3～6 cm，幼时近半球形，成熟后扁平至平展；菌盖表面深灰色、鼻烟褐色、暗褐色至近黑色，中部色较深，具深色纤丝状隐生花纹或斑纹；菌盖边缘无沟纹，有辐射状裂纹。菌褶白色；短菌褶近菌柄端渐变窄。柄长5～10 cm，直径0.5～1.2 cm，白色至淡灰色，被淡褐色细小鳞片；菌环顶生至近顶生，膜质，灰色至污白色；菌柄基部近球形，直径1～2.5 cm；菌托浅杯状，游离托檐高达3～8 mm，厚0.5～2 mm，外表面白色至污白色，内表面白色；担孢子7～9 × 6.5～8.5 μm, 球形至近球形，淀粉质。檐托内部主要由菌丝组成，其间夹杂的膨大细胞较少。锁状联合阙如。根据宏观和微观特征并参考相关文献[1]，该起事件的蘑菇样品鉴定为灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea)。

图1 灰花纹鹅膏子实体照片

Fig 1 Basidiomata of Amanita fuliginea.

2.2.2. 分子生物学鉴定结果：

基于ITS序列构建系统发育树拓扑结构图(图2)，聚类分析结果显示，本次事件的标本与5条来自Genbank的灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea)的序列聚类到同一分枝，获得极高支持率(图2, MP=100%)。根据分子生物学鉴定结果，该起事件的标本鉴定为灰花纹鹅膏。

图2  基于ITS序列构建的系统发育树(黑体突出显示的为本次事件标本序列)

Figure 2 Phylogenetic tree based on ITS dataset

2.2.3 毒素检测结果

采用超高效液相色谱-串联质谱法对中毒蘑菇样品中毒素进行检测，通过样品中所含毒素保留时间和监测离子对与标准品比较进行定性，峰面积响应值定量。检测结果显示，中毒蘑菇样品中主要检出α-鹅膏毒肽(α-AMA)、β-鹅膏毒肽(β-AMA)和二羟鬼笔毒肽(Phalloidin，PHD)，含量分别为 15.47mg/g、0.67 mg/g和2.28 mg/g (干子实体) ，γ-鹅膏毒肽(γ-AMA)、羧基三羟基鬼笔毒肽(Phallisacin，PSC)、羧基二羟基鬼笔毒肽(Phallacidin，PCD)未检出,标准品和样品总离子流图见图3和图4.

图3 标准溶液的总离子流色谱图

Fig 3 Total ion chromatogram of the standard solution

图4中毒蘑菇样品的总离子流色谱图

Fig 4 Total ion chromatogram of the poisoning mushroom samples

3 结论与讨论

鹅膏属隶属于真菌界、担子菌门、伞菌纲、伞菌目、鹅膏菌科的一类大型真菌[3]，是一个世界性分布的大属，全球己描述的物种超过650种，在我国目前已经发现有130余种[4]。鹅膏属中有的种类可以食用，有些种类有毒甚至剧毒[5]。鹅膏引起的中毒损害类型主要为神经型、急性肝损伤型和急性肾衰竭型三种[6]。灰花纹鹅膏可以造成急性肝损伤型中毒，中毒病程长且具有较长的潜伏期(一般＞6h)[7]，在我国多个地区都有中毒报道[8-12]。本次中毒事件的4个病人，潜伏期为6~13小时，初期临床表现为胃肠道症状，3例病人(另外1例病人初期未就诊)24h内肝功能指标正常，48h转氨酶开始上升，到72h肝功能指标急剧上升，丙氨酸氨基转移酶最高值达9327 U/L，天门冬氨酸氨基转移酶最高值达8911 U/L。继发严重肝功能衰竭，伴循环、肾脏、心肌、血液、凝血系统障碍综合征，最后因多器官衰竭死亡，与文献报道[13-16]的急性肝损伤型中毒临床表现一致。此次事件病人就诊及时，但由于急性肝损害型毒菌中毒早期为胃肠道症状，且流调人员、医生根据病人描述所食用的为“奶浆菌“”，没有详细询问病人进食的蘑菇种类、进食量，轻易判断病人为胃肠炎型蘑菇中毒，耽误了最佳救治时机，导致病人最后身亡。

此次中毒事件中病人所食用的灰花纹鹅膏与贵州老百姓广泛采食的“伞把菇”“三八菇”(鸡枞菌)在外观形态上有相似之处，但鸡枞菌具有细长的假根，鹅膏具有菌环、菌托。大部分村民不了解鸡枞与鹅膏区别，并且在采摘野生蘑菇时，不喜挖根，误认不挖根蘑菇就会继续生长繁殖，因此灰花纹鹅膏、拟灰花纹鹅膏等剧毒鹅膏极易被村民误认为是鸡枞菌而被采食。

贵州省受全省东南季风控制，终年温凉湿润，日照充足，且植被丰富，林中阴暗潮湿非常适合野生蘑菇生长；并且百姓非常喜食这得天独厚的山珍，但由于百姓食品安全意识薄弱，且偏信民间鉴别毒菌方法，造成贵州省蘑菇中毒事件频频发生。贵州省2016—2020年毒蘑菇中毒共报告1 173起，中毒3 996人，死亡39人，病死率0.98%，占所有食源性疾病事件数、中毒病人数和死亡人数的54.38%(1 173/2 157)、44.46%(3 996/8 988)和88.64%(39/44)。病死率在1.20%～34.48%之间，平均为12.18% [17]。可见蘑菇中毒是贵州省食源性疾病发生比例最高、造成死亡最多、危害最严重的致病因子，造成的人员伤亡和经济损失都严重威胁着人民的生命财产安全。为了防止此类悲剧的再次发生，在蘑菇中毒高发区域要开展多种形式的教育宣传，告诫老百姓民间鉴别毒蘑菇不可靠，不采、不食、不买卖野生蘑菇才是预防蘑菇中毒的有效措施；另外加强对医疗机构，特别是乡镇卫生院、村卫生室临床医生的教育培训，一旦接诊蘑菇中毒病人，特别是潜伏期大于6小时的中毒患者，应立即将病人转诊到有能力的医院进行积极救治，最大程度挽救病人生命。

致谢

感谢中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所李海蛟和章轶哲副研究员在物种鉴定、文章修改过程中给与的大力支持。

参考文献

[1] Cui YY, Cai Q, Tang LP, Liu JW, Yang ZL, 2018. The family Amanitaceae: molecular phylogeny, higher-rank taxonomy and the species in China. Fungal Diversity, 91(1): 5-230

[2] 薛荣旋,刘国平,黄莹偲,黄诚.分散固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱法快速测定毒蘑菇中的6种野生蘑菇毒素[J].食品安全质量检测学报,2021,12(17):6918-6923.

[3] 杨祝良．中国鹅膏菌属(担子菌)的物种多样性[J]．云南植物研究所，2000，22(2)： 135．142．

[4] 杨祝良. 中国鹅膏科真菌图志[M]. 科学出版社, 2015.

[5] 陈作红, 杨祝良, 图力古尔,等. 毒蘑菇识别与中毒防治 [M]. 北京: 科学技术出版社, 2016:1-308.

[6] Diaz，J．H．Syndromic diagnosis and management of confirmed mushroom poisonings [J]．Critical Care Medicine，2005，33(2)：427-36．

[7] 张志光, 周素荣, 李常明,等．灰花纹鹅膏及其毒性研究[J]．湖南师范大学自然科学学报，1997，20(1)：68．71．

[8] 邓旺秋,李泰辉,张明,肖正端,贺勇,徐隽彦.华南常见毒鹅膏菌及其中毒事件分析[J].菌物学报,2020,39(09):1750-1758.

[9] 李建国, 石新时, 陈东辉,等. 两起灰花纹鹅膏蕈中毒调查及其毒性探讨[J]. 实用预防医学, 2004.

[10] 张权义, 陈作红, 张传禄,等. 湖南省桂阳县四起毒蘑菇中毒事件的调查分析[J]. 实用预防医学, 2003, 010(001):12-13.

[11] 韩小彤, 周茜, 陈芳, 等. 2例灰花纹鹅膏中毒救治分析[J]. 中华急诊医学杂志, 2016, 25(8):1016.

[12] 刘勋,周亮,邱彬,曹永平,罗睿,廖斌,欧社祥.郴州市一起灰花纹鹅膏中毒事件调查与分析[J].中国食品卫生杂志,2021,33(05):623-627.DOI:10.13590/j.cjfh.2021.05.020.

[13] 颜芝闻,吴晓旻,裴红兵,伍雅婷,李海蛟.武汉市一起毒蘑菇中毒事件现场调查和鉴定[J].中国食品卫生杂志,2020,32(05):566-569.

[14] 何志凡,马海英,张强,骆春迎,冯敏,王希希,王瑶,李晓辉.一起条盖盔孢伞中毒事件调查[J].中国食品卫生杂志,2020,32(04):460-464.

[15] 周亚娟,俞红,朱姝,章轶哲,李海蛟.一起剧毒蘑菇新种假淡红鹅膏中毒事件调查研究[J].中国食品卫生杂志,2018,30(05):497-501.DOI:10.13590/j.cjfh.2018.05.010.

[16] 王黎荔,林丹,高四海,戴曙杰,张秀尧,蔡圆圆,山若青.一起误食毒蘑菇引起6人死亡的食物中毒调查分析[J].中国食品卫生杂志,2017,29(04):505-507.

[17] 朱姝,王娅芳,刘琳,张黎黎,田继贵,周亚娟.贵州省2016—2020年毒蘑菇中毒事件监测分析[J].现代预防医学,2021,48(15):2742-2744+2758.