江西省首起食用亚稀褶红菇中毒引起死亡事件的调查与溯源

刘洋1，梁新民2，周厚德1，游兴勇1，刘成伟1，彭思露1

(1.江西省疾病预防控制中心 江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，2.南昌大学公共卫生学院 江西省预防医学重点实验室，江西 南昌330029)

摘要：目的 调查并溯源江西省2020年9月一起误食有毒蘑菇中毒引起死亡事件的情况，为预防类似事件的发生提供参考。 方法 采用访问调查法进行流行病学描述性分析并初步判断，之后对收集的有毒蘑菇样品进行形态学和分子生物学鉴定。结果 流行病学调查发病患者均食用了野生蘑菇，未食用者未发病，平均潜伏期19分钟，病情进展迅速，出现恶心、呕吐等症状，肝肾和心功能造成损害，致死率较高，有毒蘑菇样品经形态学、分子生物学比对鉴定为亚稀褶红菇。结论 本次事件为江西省报道的首起误食亚稀褶红菇引起中毒死亡的事件，该类有毒蘑菇对人民身体健康有较大威胁，提示我省毒蘑菇中毒形势较为严峻，相关部门需要加强防控，预防类似事件发生。

关键词：食物中毒；分子鉴定；亚稀褶红菇; 致死

Investigation and Tracing of the first mushroom poisoning caused death case by

Russula subnigricans in Jiangxi

LIU Yang1, LIANG Xinming2, ZHOU Houde1, YOU Xingyong1, LIU Chengwei1, PENG Silu1

(1.Jiangxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, Jiangxi Provincal Key Laboratory of Foodborne Disease Diagnosis and Tracing, 2.Jiangxi Key Laboratory of preventive medicine,  Nanchang University public health college, Jiangxi Nanchang 330029)

Abstract Objective To investigate and tracing the first mushroom poisoning case caused death by Russula subnigricans in Jiangxi Province in September 2020. Methods Epidemiological descriptive analysis was used to make a primary judgement. Then the morphological and molecular biological identification was carried out on the collected mushroom samples. Results: The epidemiological information showed that all the patients had eaten the wild mushroom, while the others who had not eaten did not get sick. The average incubation period was 19 minutes, the disease progressed rapidly, and the symptoms of gastrointestinal discomfort, vomiting and so on had existed. The liver, kidney and heart functions were damaged, and the mortality rate was high. The morphological and molecular studies identified the samples were Russula subnigricans. Conclusion: This incident is the first reported poisoning death event in Jiangxi Province caused by eating Russula subnigricans by mistake. This kind of poisonous mushroom has a great threat to people's health, which indicates that the poisoning situation of poisonous mushroom in Jiangxi Province is relatively serious, and relevant departments need to strengthen prevention and control to prevent similar incidents.

Key words: Food poisoning; Molecular identification; Russula subnigricans; Lethal

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基金项目：江西省卫健委科研项目(20204844, 202211286)

作者简介：刘洋 男 主管技师 研究方向为食品安全风险监测 E-mail:cpuprotein@163.com

通信作者：彭思露 女 主管技师 研究方向为食品安全风险监测 E-mail:531886366@qq.com

我国拥有的蘑菇种类繁多，其中可食用的蘑菇超过1000种，但是毒蘑菇种类也高达480多种，其中含剧毒可致死的蘑菇有40多种[1]。毒蘑菇是大型真菌子实体，误食可引起急性中毒反应[2]。在我国云南、贵州、湖南、江西等地，当地居民均有采摘和食用野生蘑菇的习惯，故这些地区野生蘑菇中毒事件时有发生[3]。研究表明，误食毒蘑菇已成为我国食品安全事故的致死的头号因素，在江西，毒蘑菇中毒也是造成食源性疾病死亡的主要原因[4]。本研究主要是对2020年9月在江西省县发生的一起食用野生蘑菇中毒引起死亡的事件进行调查，了解蘑菇中毒的基本状况和特征，同时对中毒样本进行了分子生物学等方面的分析。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

PCR仪(德国Eppendorf)，凝胶成像系统(美国Bio-Rad)，离心机(美国Corning)。

Dneasy plant Mini Kit(中国天根)，2×Taq PCR Master Mix(日本Takara)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(中国天根)，Gel-Red(美国Biotium)，引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查

1.2.1.1研究对象

选取事发某两家庭近期具有一起用餐史人员作为研究对象。

1.2.1.2病例定义

2020年9月20日某两家庭成员中出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛症状者。

1.2.1.3研究方法

采用访问调查法，对事发病例患者家属和其临床医生进行访问调查，收集患者的人口学特征、饮食史、和临床特征。同时对与患者近期具有饮食史相关联的家庭人员进行调查其人口学特征和饮食史等信息。

1.2.2 毒物鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定

将采集的病家剩余未加工的野生蘑菇样本与书籍、网络上类似的蘑菇形态描述以及图片进行形态学比对，通过分析菌盖直径和颜色、表面特征，菌褶的颜色、疏密程度，菌柄的长度、直径、基底形状等的形态特征进行初步判定[5]。同时将样本烘干后寄送省中心进行分子生物学鉴定。

1.2.2.2 分子生物学鉴定

采用DNA条形码技术进行分子生物鉴定。将-20℃冻存的毒蘑菇取出，用粉碎机粉碎，之后用天根的植物DNA提取试剂盒进行DNA提取，操作按照试剂盒说明书进行。扩增片段为ITS(Internally Transcribed Spacer, 内源转录间隔区)，引物为ITSF(GGA AGTAAAAGTCGTAACAAGG)和ITSR(TCCTCCGCTTATTGATATGC)。构建50μL PCR反应体系(25μL Taq PCR MasterMix，5μL正反向引物，1μL模板DNA，19μL水)，其反应条件为98℃预变性5min；98℃变性5s，58℃退火5s，72℃延伸5s，40个循环后72℃延伸10min，4℃保温。5μLPCR产物电泳后进行胶回收，胶回收过程参考相应试剂盒说明书，之后将回收产物16℃过夜与PUC19载体进行连接，连接产物转染感受态细胞后通过蓝白斑筛选，白色克隆为阳性克隆。将单克隆过夜培养后送生工生物进行测序[6]。

1.2.2.3 DNA序列分析

    将测序返回的结果用用美国生物技术信息中心(NCBI)的blast工具进行序列比对，获得ITS匹配度高的分类结果。从GenBank下载相似蘑菇的序列，相似蘑菇参考文献获得，采用MEGA10.1软件构建系统发育树，系统发生树采用neighbor-joining方法进行计算，用Bootstrap对系统树进行检验，1000次重复。通过对进化树的拓扑结构及其稳定性分析蘑菇样品归到属和种[7]。

2 结果

2.1流行病学基本情况

2.1.1基本情况

中毒事件发生在江西省某县的一小乡村里，该村约有村民200多人，此次中毒事件为该村首次出现，之前未出现过蘑菇中毒事件。事件共涉及相关人员共7人，是当地的长居人口，均无外出旅行及特殊机构到访史，其中患者有6人，系一家五口及邻居一人。当地村民有采集和食用野生菌的既往史，本次中毒的2户人家既往也有采集和食用野生菌的情况。当地居民对有毒野生菌有一定的鉴别能力，多从颜色等方面进行辨别，不一定能正确区分亚稀褶红菇。

2.1.2人群分布

年龄、性别构成如下表1：其中中毒患者中男性占33.3%，年龄在41-60岁占66.6%，大于61岁的患者占33.3%。

表1年龄、性别分布表

2.1.3时间分布

此次中毒事件患者最早在2020年9月20日12时25分出现，最后一例病例出现在2020年9月20日12时40分，其中最短潜伏期为15分钟，最长潜伏期为20分钟，平均潜伏期为19分钟，潜伏期中位值为20分钟。

2.1.4进食史

根据患者家属、经管医生、当地村委会干部及知情人士等调查得知，6名患者发病前，均食用了从山上采摘的野生蘑菇，以进食蘑菇菌汤为主，随后即出现了相似症状，其中患病邻居家庭中，其子与其共同用餐，但未食用蘑菇，未发病。

2.2临床表现及救治

病例1，江某于9月20日12时许在家中进食自采野蘑菇后出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛等症状，经乡村医生检查后转县中医院就诊，入院诊断为：食入性毒蘑菇中毒、肺气肿和胃大部分切除术后。患者入院后病情进展迅速，出现进展性呼吸困难、神志淡漠，予气管插管、呼吸机辅助呼吸，并给予：床旁CRRT(血液滤过)、洗胃、制酸护胃、保护肝肾功能、纠正酸中毒及补液支持等对症支持治疗。9月22日于3:47出现血压、心率下降，中医院救治领导小组立即再次组织抢救并同时与上级专家沟通，优化救治方案，予心肺复苏、心脏电除颤、稳定血压、呼吸机辅助呼吸、血浆置换等抢救治疗，最后因抢救无效死亡。

病例2，江某于9月20日12时许在家中进食野蘑菇后出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛等症状，前往中医院就诊，入院诊断为：毒蘑菇中毒;和高血压病。患者入院后病情进展迅速，出现胸闷、气急和呼吸困难加重，肝肾功能进一步损害，心肌酶持续升高，心功能损害进一步加重，予气管插管、呼吸机辅助呼吸、床旁CRRT、洗胃、制酸护胃、保护肝肾功能、纠正酸中毒及补液支持等对症支持治疗。10月10日转省内大型三甲医院继续治疗。10月19日重新转回县中医院，入院诊断：1、食入毒蘑菇中毒；2、急性肾功能衰竭；3、急性心力衰竭；4、肺炎；5、呼吸衰竭；6、创伤性硬脑膜下血肿；7、额骨骨折；8、中度贫血。治疗上给予：输氧、心电监护、CRRT、抗感染、制酸护胃、减慢心室率、抗心衰及补液支持等对症治疗。10月31日转浙江省中医院治疗。

病例3，江某自述9月20日12时许在家中进食野蘑菇后出现恶心、呕吐、腹泻、腹痛等症状，于21:50时来中医院就诊，入院诊断为：1、食入性毒蘑菇中毒；2、慢性阻塞性肺病；3、高血压病。患者入院后病情进展迅速，出现神志淡漠、呼吸困难，之后肝肾功能进一步损害、心肌酶持续升高，心功能损害进一步加重，凝血功能紊乱加重合并上消化道出血，病危。治疗措施：气管插管、呼吸机辅助呼吸，心电监护、洗胃、床旁CRRT、血液灌流、血浆置换、抗感染、纠正低蛋白血症、制酸护胃、保护肝肾功能及补液支持等对症支持治疗。最后好转出院。

病例4，江某于9月20日12时在家中进食野蘑菇后出现恶心呕吐、腹泻等症状，于19:37分入院就诊，入院诊断为：1、食入毒蘑菇中毒，代谢性酸中毒；2、高血压1级。因呼吸窘迫于9月21日晚8点左右行气管插管、呼吸机辅助呼吸，肝肾功能进一步损害、心肌酶持续升高，心功能损害进一步加重，病危。治疗措施：输氧、心电监护、床旁CRRT、洗胃、制酸护胃、保护肝肾功能、纠正酸中毒及补液支持等对症支持治疗。10月19日好转出院。

病例5，单某，因恶心、呕吐，于19:37分入院就诊。自述9月20日12时在家中进食野蘑菇后出现恶心呕吐、腹泻等症状，入院诊断为：1、毒蕈中毒；2、肾功能不全；3、高血压1级。之后肝肾功能进一步损害、心肌酶持续升高，心功能损害进一步加重。治疗措施：气管插管、呼吸机辅助呼吸、血液灌流、血浆置换、床旁CRRT、ECMO、洗胃、保护肝肾功能等对症支持治疗。10月6日凌晨1时许，出现心脏停搏、血压测不出，予补充血容量、升压、心肺复苏等抢救治疗，仍未能恢复自主心室率，最后抢救无效死亡。

病例6，鲍某系同村村民，自述2020年9月20日12时在家中进食野蘑菇后出现恶心呕吐等症状，于21:50时来中医院就诊，入院诊断为：食入性毒蘑菇中毒、2型糖尿病和高血压病。入院时血检示：血常规、肝肾功能、凝血功能无明显异常。随后肝肾功能进一步损害、心肌酶持续升高，心功能损害进一步加重，病危。治疗上给予：输氧、心电监护、洗胃、血液灌流、血浆置换、CRRT、抗感染、护肝、制酸护胃、改善肾功能、控制血压及血糖、纠正酸中毒及补液支持等对症支持治疗。最后好转出院。

2.3 形态学鉴定

当地疾病预防控制中心接到相关信息后，立即组织人员前往患者家中采集剩余未食用的有毒蘑菇，将采集的样本与书本、网络中的图片进行比对，观察到子实体中等大。菌盖浅灰色至煤灰黑色。菌盖直径6-11.8cm，扁半球形，中部下凹呈漏斗状，表面干燥，有微细绒毛，边缘色浅而内卷，无条棱。菌肉白色，受伤处变红色而不变黑色。菌褶直生或近延生，浅黄白色，伤变红色，稍稀疏，不等长，厚而脆，不分叉，往往有横脉。烘干后该有毒蘑菇不会完全变黑，菌褶有部分地方不会发生颜色变化。详见图1。

2.4分子生物学鉴定

将ITS片段测序结果递交NCBI数据库进行比对，比对结果显示为亚稀褶红菇，匹配度为98%，详见图2。

图2 序列比对结果

Fig2 The result of sequence alignment

2.5 进化树构建

应用ITS片段构建亚稀褶红菇的系统发育树，系统发育结果表明检测的样本RNtest1与亚稀褶红菇的ITS序列聚类到同一分支，获得了较高的支持率，鉴定样本为亚稀褶红菇，详见表1和图3[3]。

表1 用于亚稀褶红菇系统发育树分析的ITS片段信息

Table1 The ITS Fragment Informations for Phylogenetic Tree Analysis

图3 进化树结果展示

Fig3 The result of the relation tree

3 讨论

近些年来，蘑菇中毒事件频频发生，其中亚稀褶红菇作为毒蘑菇新发物种，主要表现为高毒性与高致死率，同时中毒患者的预后表现较差[8]。每年的6月至9月的夏秋季间，便是该毒蘑菇生长的季节，在我国很多地区的山毛榉科植物混交林均有生长，被列为我国剧毒蘑菇之一[9]。根据2004—2011年22个省份通过突发公共卫生事件报告管理信息系统报告毒蘑菇中毒事件显示,稀褶红菇、毒红菇、亚稀褶红菇中毒事件死亡人数所占比例为16.4%，仅次于占比为44.1%致病白毒伞[10]。

本研究是关于一起亚稀褶红菇中毒事件的调查，此种蘑菇在江西省的报道相对较少，暂未发现此种蘑菇在江西省引起中毒死亡的案例报道。因此，本研究对该种蘑菇的中毒状况和特点进行了丰富和补充，同时对食物中毒事件的处理提供了一定的借鉴和参考。在此次事件中，中毒人群的主要特征表现为家庭聚集性，同时还表现出中毒人群的邻里关系，这与很多地区有毒蘑菇往往家庭聚集、散发特征相一致[11]。本研究中，患者亚稀褶红菇中毒，潜伏期短，首先出现的是恶心、呕吐等一般性的食物中毒症状，接着便是对肝肾功能的损害，心肌酶持续升高，对心功能产生严重的危害性，与同种类的蘑菇中毒其他相关研究相似[8]。浙江地区亚稀褶红菇患者不管是因为误食仅该种蘑菇还是与多种毒蘑菇混合在一起导致的中毒均出现蕈样症状、横纹肌溶解以及肌酸激酶的快速升高。采取的应对措施主要是给予患者对症的一些营养支持治疗和血液灌流，与此同时，还包括对患者的连续性肾脏替代治疗和血浆置换[8,12]。据学者统计2004—2014年全国毒蘑菇中毒病死率高达21.24%,死亡人数占食物中毒总死亡人数的35.57%[13]，本研究中，蘑菇中毒致死率达到33.3%，已经远远高于全国的平均水平，其他研究表明该类蘑菇中毒的病死率均较高，2004-2011年，22省份上报的毒蘑菇中毒情况显示，亚稀褶红菇引起的死亡人数占比为16.4%，排名仅次于致命白毒伞[14]。2014年浙江省德清县发生一起5人食用亚稀褶红菇引起中毒的时间，其中2人因多器官衰竭死亡[15]。本研究中，流行病学调查提示为有毒蘑菇中毒，形态学、ITS菌种鉴定方法比对结果以及系统发育树鉴定结果均显示本次事件为误食亚稀褶红菇引起的食物中毒事件。DNA条形码技术被广泛用于大型真菌物种的鉴定，由于有毒蘑菇中毒事件中往往较难获得原始样本，因此ITS鉴定方法是目前国际上较为公认的物种识别方法，本研究采用该方法进行测序比对获得了较好的匹配性，同时系统发育树结果显示获得的序列与亚稀褶红菇为同一分支，确定了本次中毒事件的有毒蘑菇种类[7]。

本研究为该村庄第一次发现的蘑菇中毒事件，该地居民应提高警惕，在对存在中毒风险的人群，也就是这些有着采食野生蘑菇习惯的人群或者购买其他人群已经采摘好的野生蘑菇的人群，应该进行重点的预防野生蘑菇中毒知识的科普宣传，使得当地居民能够更加全面和准确的了解毒蘑菇，因为很多毒蘑菇在生长的不同时期，特异性外观特征并不相同，极易与可食用蘑菇混淆，因此，预防野生蘑菇中毒最好的方式依然是建议不要采食野生蘑菇。农村家庭是主要的发生场所，发生原因主要为误采误食，应对高发季节和高发省份进行重点监测和管理,同时加强重点地区医疗卫生人员可疑有毒蘑菇采集、鉴定能力培训，开展预防蘑菇中毒健康宣传[16]。

然而本研究存在一些不足之处，首先在调查上可能存在信息偏倚。由于事发紧急在加上该种蘑菇中毒的发病快，并且病情进展迅速，当信息上报后进行开始现场调查的时候，患者已经生命垂危，不能参与调查，只能通过对患者的家属和医生来了解患者的信息，这其中极大可能造成一定的信息偏倚。同时，此调查未进行后续的随访跟踪调查，具体了解之后患者预后的生活状况。在调查中，部分患者已经出现转诊治疗，对最后的结局情况依然是未知的，缺乏对患者结局的完整信息。对该蘑菇中毒治疗之后的预后效果如何，还值得今后不断的研究。

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