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(上海市浦东新区疾病预防控制中心，上海  200136)

摘  要：食源性寄生虫病是重要的公共卫生问题之一，也是寄生虫病防治工作面临的新挑战。其潜伏期长、无疫苗、无终身免疫力、对人群健康可造成严重危害的特点，对该疾病的预防尤为重要。如何快速检测食品中的寄生虫是未来防控工作主要发展趋势。本文对目前食源性寄生虫领域主要运用的检测技术，如免疫磁珠分离法(IMBS)、免疫层析法(ICA)、多重聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)、序列分析法等进行综述，为食品中寄生虫的快速检测及鉴别提供技术手段，保障食品安全。

关键词：食源性寄生虫；检测技术；食品安全

Progress in the detection of food-borne parasites

CAI Xuyue，LU Xinchen，LU Qi，LIU Hanzhao，YU Siyu

(Pudong New Area Center for Disease Control and Prevention，Shanghai 200136，China)

Abstract:  Food-borne parasitic diseases are one of the important public health problems and a new challenge for the prevention and control of parasitic diseases. It is characterized by long incubation times in humans, no vaccine, no lifelong immunity and can cause serious harm to the health of the population, making prevention particularly important. How to rapidly and accurately detect parasites in food is also the major development trend of future prevention and control work. This article reviews the detection techniques mainly used in the field of food-borne parasites, such as immunomagnetic beads separation techniques (IMBS), immunochromatographic assay (ICA), multiplex polymerase chain reaction (PCR), loop-mediated isother-mal amplification (LAMP), recombinase polymerase amplification (RPA), recombinase-aided isothermal amplification (RAA), sequence analysis, etc., so as to provide technical means for the rapid detection and identification of parasites in food and ensure food safety.

Key words：Food-borne parasites; technical means; food safety

食源性寄生虫病(food-borne parasitic diseases, FBPDs)是指通过生食或半生食含有寄生虫的食物而感染。目前，已知约有300种寄生虫和70种原生动物会感染人类和动物[1]。联合国粮食及农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)基于全球疾病数量、发病率和死亡率排出了全球食源性寄生虫(food-borne parasites, FBPs)前四名：猪带绦虫、细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和弓形虫[2]。我国常见FBPs包括华支睾吸虫、并殖吸虫、带绦虫、旋毛虫、弓形虫、广州管圆线虫等6种[3]，其中华支睾吸虫，又称肝吸虫，在我国流行最严重[4]。

FBPDs已成为一个不容忽视的公共卫生问题[5]。2015年全国第三次人体重点寄生虫病现况调查显示[6]：全国18个省(直辖市、自治区)发现华支睾吸虫感染，前三分别是广西、广东和黑龙江。全国华支睾吸虫感染率0.6%(3466/617441)，主要分布在华南和东北两大片区。WHO发布的全球食源性疾病负担首次评估报告中，有31种病原体引起食源性疾病负担，导致全球6亿人患病，42万人死亡，其中2010年全球食源性疾病负担为3300万伤残调整生命年(DALYs)[7]。在欧洲，93%的猎人会赠送或出售未经寄生虫检测的肉类和自制产品(如生香肠)，因此可能至少有12吨受感染的肉类引入市场[8]。加纳库马西阿散蒂地区(Pankrono-Kumasi, Ghana)当地鸡和外来鸡[9]、意大利猪肉[10]和南部地中海贻贝[11]、伊朗食用的生蔬菜[12]中皆存在不同寄生虫感染现象。2014-2022年，在埃塞俄比亚地区，蛔虫、溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫和钩虫是食品从业人员感染最普遍的寄生虫，食用生蔬菜和肉类是感染显著的相关因素之一[13]。我国部分地区对FBPs的监测也发现食品中存在不同程度感染。王真瑜等[14]对2015-2019年上海市市售食品寄生虫感染进行监测分析，结果发现：淡水类水产品中寄生虫囊蚴阳性率为0.8%(9/1125)；海水类水产品中异尖线虫幼虫阳性率为31.1%(184/591)；黄泥螺腌制品中棘口吸虫囊蚴阳性率为61.4%(272/443)。关博宇[15]等对2011-2016年江门市市售食品食源性寄生虫进行污染状况调查，在淡水鱼中检出华支睾吸虫和东方次睾吸虫，检出率为5.98%(67/1120)。龙岩市[16]、深圳市[17]、连云港市[18]等也均发现食品中有寄生虫污染的情况。

目前大多数FBPDs无人体疫苗，且潜伏期较长。临床上主要使用吡喹酮、阿苯达唑、三苯双脒、三氯苯达唑类等抗虫药物，近年来发现一些寄生虫对某些药物已产生了耐药性[19]。FBPs的检测方法包括病原学检验[20, 21]、免疫学检测[22, 23]、分子生物学检测[11, 24]等，只依靠一种方法进行检测难免漏诊、误诊，因此常多种方法联合判断。实际工作中，往往有大规模的食品需要检测，因此快速检测技术需大力发展和广泛应用。本文就目前应用的相关检测技术进行阐述。

1 病原学检测方法

病原学检测最原始、最直接，虽然费力但通常是检测的首选[1]，包括直接压片法、消化法、烛光法、挤压烛光法、机械分离沉降法和浓缩集卵法[25]。该方法简单低廉，但易受采样部位、采样量等因素影响，且要求检测人员对镜下囊蚴形态的鉴别能力较高，因此易漏检、误检，且难以进行大规模的食品检测[26]。

直接压片法是直接将样品压片后镜检，以观察到成虫或虫卵为判定依据。常用于肉类中囊尾蚴和旋毛虫幼虫[27]、鱼肉中寄生虫囊蚴的快速检测[28]。

消化法是利用蛋白酶消化液直接消化样品，消化时间不超过24小时，虫体或囊蚴因其结构的特殊性，不易被同步消化掉，从而分离鉴别[28]。该法适用于检测肉类中的囊尾蚴、旋毛虫、住肉孢子虫、弓形虫[20]以及鱼类和贝类中的吸虫囊蚴、有棘颚口线虫包囊、广州管圆线虫幼虫、阔节裂头绦虫裂头蚴等[25]。该法优点为有效提高检出率，但所需时间较长，不适合大规模检测[28]。

烛光法分为白光烛光法和紫外光烛光法，适用于检测鱼肉中的吸虫囊蚴、有棘颚口线虫包囊、广州管圆线虫幼虫和阔节裂头绦虫裂头蚴等。白光烛光法是利用白色透射光和反射光的共同作用，使虫体呈不同颜色或阴影，适用于检测新鲜或冷冻的白色鱼肉样本；紫外光烛光法是利用UV光在暗房中观察样品各个部位，虫体会发出蓝或绿色荧光从而辨别，适用于检测深色鱼肉的样本[25, 28]。虽简便快速, 但准确率较低[29]。

挤压烛光法是将样品夹于有机玻璃夹板内，通过观察白色透光台上阴影部分辨别虫体。主要用于检验半透明贝类肉中的吸虫囊蚴[25]。

机械分离沉降法是通过过滤、沉降等手段将虫体或囊蚴分离出来，在显微镜下鉴别，操作简单、快速。适用于检测水果、蔬菜中的寄生虫囊蚴[21]；淡水甲壳类中的并殖吸虫囊蚴；螺类吸虫囊蚴、线虫幼虫和鱼肉中的吸虫囊蚴、有棘颚口线虫包囊、广州管圆线虫幼虫和阔节裂头绦虫裂头蚴等[25, 28]。

浓缩集卵法是通过静置的方式，使虫体自然沉降，沉淀物进行染色后在显微镜下鉴别形态。适用于检测新鲜蔬菜中的毛首鞭形线虫卵和蛔虫卵[25]。

2 免疫学检测方法

2.1 免疫磁珠分离技术(IMBS)

免疫磁珠(IMB)是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，由载体微球和免疫配基结合而成。IMBS则是利用免疫磁珠上包被的特异性抗体与抗原发生亲和反应，从复杂的样品中分离到目标抗原，再利用磁珠的磁响应性，实现对目标抗原的富集[30]。该技术检测时间短、操作简单、具有高度专一性以及固相化试剂所特有的优点[30, 31]，常与其他检测方法结合使用，广泛应用于食品检测中。

Marques等[32]采用IMBS浓缩绿叶蔬菜和水果中的弓形虫卵囊，同时达到去除潜在的隐孢子虫和贾第鞭毛虫卵囊的目的。姜阜杉等[31]通过化学结合使弓形虫CST1以及BSR4多克隆抗体与磁珠相结合，利用此种免疫磁珠富集猪肉样品中的弓形虫包囊以及缓殖子，将富集后的样品再提取基因组DNA，进行后续分子生物学方法的检测，极大提高了检测的敏感性，解决了因组织包囊在猪体内的浓度很低而使检出率低的问题。

2.2 免疫层析技术(ICA)

ICA操作简单，便于携带，适合现场检测，具有较好的应用前景。孙恒昌等[33]以草鱼为模型，制备纯化了兔抗草鱼IgM的IgG多克隆抗体，建立了淡水鱼华支睾吸虫囊蚴感染的免疫层析试纸条技术，能在10 min左右完成对草鱼血清中特异抗体的检测，且血清稀释到1∶500后依然能被检测出，特异性较好。寇金华等[34]研制猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条，初步应用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液，标记抗弓形虫重组蛋白SAG3的单克隆抗体(Anti-A-SAG3-7)并对其标记条件进行优化，该方法的敏感性达1：160，适用于时间紧、样品数量大的检测，为猪弓形虫病的早期诊断提供了一种快捷、实用的方法。王新宇等[35]开发了基于铕(III)螯合微粒(ECM)的新型侧流免疫试纸(ICS)，适用于猪血清和全血样本中旋毛虫的快速检测，3min即可完成。

2.3 其他免疫学检测技术

主要包括免疫标记技术和酶联免疫吸附法(ELISA)。纳米金标记技术具有高灵敏、高通量、高效率的优势[36]，因纳米金独特的理化性质和制备方法简单、性质稳定、检测速度快的特点广泛应用于食品检测中。KOCHANOWSKI等[37]分别建立了化学发光夹心ELISA法和化学发光竞争ELISA法检测人工污染的鱼罐头中的简单异尖线虫，发现化学发光夹心ELISA法更适合。Duong等[38]发现荧光素酶融合刚地弓形虫抗原rNluc-GRA6，rNluc-GRA7和rNluc-GRA8相较商业ELISA检测试剂盒具有更高的灵敏度(90.0%)和特异性(96.3%)，并成功建立了快速荧光素酶联抗体捕获试验(Rapid-LACA)检测猪肉中的弓形虫，30min内即可完成。

3 分子生物学检测方法

3.1 多重聚合酶链式反应(PCR)

多重PCR就是在一个PCR反应体系里，同时扩增多个核酸片段或同一核酸片段的不同区域，克服了普通PCR缺点，实现了对多种病原微生物的同时检测[39]。高俊峰等[40]建立了淡水鱼中东方次睾吸虫、华支睾吸虫和日本全冠吸虫的三重PCR检测方法，能分别扩增到508 bp、311 bp和208 bp的目的条带，3种吸虫囊蚴重组质粒标准品检测下限均为104拷贝/μL。用该法检测52尾淡水鱼样品中吸虫囊蚴的感染情况，结果共30尾阳性，其中有25尾是两种或三种吸虫囊蚴混合感染。胡坤敏等[41]建立了检测卫氏并殖吸虫、斯氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴的多重荧光定量PCR方法，检测到的最低浓度为：卫氏并殖吸虫3.05×102 copies/μL、斯氏并殖吸虫 3.21×103 copies/μL、三平正并殖吸虫3.22×102 copies/μL，为溪蟹中并殖吸虫囊蚴的快速鉴别提供技术支持。

3.2 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是用一套4条特异性引物与靶基因的6个不同区域退火杂交, 并在活性功能的DNA聚合酶的作用下, 实现等温条件下扩增DNA分子的一种技术[42]。与PCR法相比，不受实验室环境、仪器设备等方面的限制，具有便捷快速和高灵敏度的优点，更适用于低浓度的DNA检测和现场检测。Lalonde等[43]建立了由贾第鞭毛虫EF1α基因的LAMP法检测绿叶蔬菜中的贾第鞭毛虫，该法对长叶莴苣和春季蔬菜等嫩绿叶蔬菜更敏感。朱海等[44]建立了一种检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的LAMP方法，以华支睾吸虫ITS2基因序列为靶序列，比较三组合成引物Cs-1、Cs-2、Cs-3，发现Cs-3的灵敏度及特异度最优，以其建立的反应体系，检测华支睾吸虫成虫DNA的最低检出浓度可达到3.33×10-4 ng/μL，敏感性和特异性与PCR法一致，均为100%。乔艳等[45]将LAMP结合流动试纸条(LFD)建立了海鱼中简单异尖线虫或派氏异尖线虫的快检技术LAMP-LFD，总检测时间在50min内，包括40min的核酸扩增，5min的探针杂交和3-5min的LFD检测，检测灵敏度可达单条虫体基因组DNA的10-5倍。

3.3 重组酶聚合酶扩增(RPA)

RPA是在高效的重组酶参与下，不需要模板链的热变性，可在恒温(25-42℃)条件下快速扩增出目的片段，该技术耗时短、操作简便、灵敏度和特异性高，适合用于现场快速检测[46, 47]。陈秀琴等[48]以rDNA内转录间隔区(ITS)区域为靶标，将SYBR Green I与RPA结合快速检测鱼类样品中的异尖线虫，37℃20 min内可完成，阳性呈绿色，阴性呈无色。张春玲等[49]根据华支睾吸虫囊蚴的COX-1基因序列设计引物，建立检测华支睾吸虫囊蚴的RPA方法，5 min可看到目的片段，灵敏度可达到2.75 ng/μL；对麦穗鱼样品进行检测，可视化检测效果良好，阳性RPA检测管呈现黄绿色荧光，阴性呈橘色。王金红等[46]将扩增产物与荧光探针结合，建立基于弓形虫B1基因的Exo-RPA检测方法，并对180份肉类样品进行弓形虫检测，阳性率为7.8%(14/180)，结果与荧光定量PCR检测一致。该法有良好的敏感性、特异性和重复性，最低检测限达到 102copies/μL，其灵敏性是荧光定量PCR的10倍。

3.4 重组酶介导链替换核酸扩增技术(RAA)

RAA是一种最新体外等温扩增技术，无需通过反复升温和降温解链便能实现在同一个温度下持续扩增，反应温度较LAMP法更接近于室温，反应时间更短[50]，最大限度避免了气溶胶污染问题，操作简便且稳定性好。王兆华等[51]建立实时RAA检测猫和猪血液中的弓形虫，36℃反应25min，最低检测限可达102弓形虫基因组。邓艳等[52]首次建立了针对斯氏并殖吸虫cox1基因的荧光RAA检测方法，从溪蟹样本中提取基因组DNA进行分子鉴定，反应10-15 min即可观察到目的片段扩增与否，是目前并殖吸虫核酸检测中所需时间最短的方法，在溪蟹现场快速检测与虫种鉴定中具有潜在应用价值。

3.5 序列分析法

序列分析法检测灵敏度高、扩增特异性强、产物单纯、对检测人员的技术要求较低，更符合现代检测方法的要求，但对实验设备的要求及检测成本较高，基层普及难度较大。龙晓蕾等[53]建立了鱼类华支睾吸虫囊蚴的分子生物学检测方法，选择华支睾吸虫的线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(Cox1)基因和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶第Ⅰ亚基(Nad1)基因的部分序列作为扩增位点，对鱼类肌肉中华支睾吸虫囊蚴的感染情况进行检测，结果发现，较Nad1基因，基于Cox1基因建立的序列分析法检出率更高，其特异性和灵敏度均更优。因此，更推荐Cox1基因作为鱼类中华支睾吸虫囊蚴的检测靶标。

4 展望

FBPDs种类多、分布广、危害大[54]。寄生虫可以通过不同食物链感染人类，如“从农场到餐桌”、“从森林到餐桌”、“从池塘、海洋、淡水到餐桌”等[55]。虽有抗虫药物，但耐药性的出现使新药物的研发迫在眉睫；疫苗的开发，包括人体疫苗和动物疫苗，以及新型快速检测技术、溯源和监测技术的研发皆是今后的重要研究方向。同时，制定、修订和完善食源性寄生虫病原检测技术新标准和建立基于完整检测数据基础上的食源性寄生虫监测、预警体系，也是保障食物安全和公共卫生安全的重要手段。检测技术之间相联合有助于使食品中寄生虫的现场和基层检测更为快速、准确，达到保障食品安全，减少FBPs给人类健康带来危害的目的。

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