一起由F型产气荚膜梭菌引起食物中毒事件的病原学分析
弋英 郭凯 肖华 周彤 刘晓琳
(青岛市疾病预防控制中心 青岛市预防医学研究院，山东青岛 266032 )
摘要： 目的 研究一起由F型产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件的病原学特征，并对传统检测方法进行改进和优化，为食物中毒事件实验室检测提供新的思路和方向。方法 利用多重实时荧光PCR 方法进行病原菌初筛，根据初筛结果用单重PCR方法进行确认，根据确认结果进行细菌分离培养和菌种鉴定，同时进行相关毒素检测；分离的菌株利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分子分型，采用 BioNumerics7.6 软件对菌株的PFGE指纹图谱进行聚类分析。
结果 多重实时荧光PCR 检测结果显示12份粪便标本中检出产气荚膜梭菌核酸阳性10份；食品肉夹馍标本中检出产气荚膜梭菌核酸阳性1份；其它食品标本和环境标本未检出相关病原菌核酸。利用产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒对初筛阳性的标本进行再次确认，10份粪便标本和1份肉夹馍均检出产气荚膜梭菌核酸阳性；并经常规细菌分离培养、菌种鉴定再次确定为产气荚膜梭菌，其它致病菌未培养出；其中10份粪便标本中产气荚膜梭菌计数>1.0X106 CFU/g， 肉夹馍标本中产气荚膜计数为6.5 x 103 CFU/g，通过PFGE分子分型得知11份标本中检出的菌株指纹条带图谱完全一致，相似度为100%。10份患者粪便标本和1 份食品标本中分离株毒素携带情况完全一致，均含有产气荚膜梭菌α毒素和肠毒素(CPE)，故确定为F型产气荚膜梭菌。结论 此事件是一起由F型产气荚膜梭菌毒素导致的细菌性食物中毒事件，今后实验室要提高产气荚膜梭菌引起的食物中毒的检测能力，尤其基层，防止漏检。
关键词：产气荚膜梭菌；食物中毒；脉冲场凝胶电泳；毒力基因
收稿日期：2023-5-15
作者简介：弋英 女 副主任技师 研究方向为病原微生物 E-mail：2564514232@qq.com
通信作者：刘晓琳 女 主任技师 研究方向为病原微生物 E-mail：lindaliu236bx@163.com
Etiological analysis of a food poisoning incident caused by Clostridium perfringens type F
YI Ying，GUO Kai， XIAO Hua，ZHOU Tong，LIU Xiaolin
(Qingdao Center for Disease Control and Prevention ，Qingdao Institute of Prevention Medicine，Shandong Qingdao 266033, China)
Abstract: Objective To study the etiological characteristics of a food poisoning incident caused by Clostridium perfringens F type, and improve and optimize the traditional detection methods, so as to provide new ideas and directions for the laboratory detection of food poisoning incidents.
Methods Multiple real-time fluorescence PCR method was used to conduct primary screening of pathogenic bacteria. According to the preliminary screening results, the single PCR method was used to confirm the bacteria. According to the confirmed results, the bacteria were isolated and cultured, the strains were identified, and the related toxins were detected. The isolated strains were moleculically categorized by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), and the PFGE fingerprints of the isolates were analyzed by BioNumerics 7.6 software.
Results The results of multiple real-time PCR showed that 10 out of 12 fecal samples were positive for Clostridium perfringens nucleic acid. 1 Clostridium perfringens nucleic acid was detected positive in food Rou Jia Mo specimen. Other food specimens and environmental specimens did not detect related pathogen nucleic acid. Clostridium perfringens nucleic acid test kit was used to confirm the positive samples, 10 stool samples and 1 Rou Jia mo were tested positive clostridium perfringens nucleic acid; It was confirmed to be Clostridium perfringens by conventional bacterial isolation and culture, and no other pathogenic bacteria were cultured. Count of Clostridium perfringens in 10 fecal samples > The capsular count of the Rou Jia mo specimen was 6.5 x 103 CFU/g. According to the PFGE molecular typing, the fingerprint bands of the strains detected in the 11 samples were completely consistent, and the similarity was 100%. The toxin isolated from 10 fecal samples of patients and 1 food sample were completely consistent with each other, which all contained Clostridium perfringens alpha toxin and enterotoxin (CPE), so it was determined to be Clostridium perfringens type F.
Conclusion This incident is a bacterial food poisoning incident caused by Clostridium perfringens toxin F type. In the future, the laboratory should improve the detection ability of Clostridium perfringens caused food poisoning, especially at the grassroots level, to prevent missing detection.
Keywords: Clostridium perfringens; Food poisoning; Pulsed field gel electrophoresis; Virulence gene
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)为厌氧芽孢菌属中能引起人类严重疾病的重要致病菌。产气荚膜梭菌的疾病病因主要是由于它能够产生一系列毒素。到目前为止，已经鉴定出产气荚膜梭菌能够产生超过20种毒素。根据它们携带编码这些毒素中的6种(alpha, beta, epsilon，和iota毒素，CPE和NetB)的基因，产气荚膜梭菌菌株被分为7种毒素类型(A型到G型)。在这种分类方案中，F型菌株携带编码α毒素和CPE的基因[1,5]。
F型产气荚膜梭菌是人类第二大常见的食源性细菌性疾病[6]。在美国，F型产气荚膜梭菌食物中毒(FP)每年影响约100万人，每年造成3.1亿美元的经济损失[7,8]。在国内，产气荚膜梭菌导致的食物中毒事件报道较少，因为其存在较为普遍以及受厌氧条件的限制，在处置食物中毒事件中容易被忽略，从而导致漏检。
产气荚膜梭菌F型由产气荚膜梭菌CPE的分离株组成，但不产生β-毒素、ε-毒素或ι-毒素[9]。F型菌株的肠道毒性主要归因于它们产生产气荚膜梭菌CPE。一种与claudin受体结合的35-kDa成孔毒素[10,11]。在某些易感条件下，当肠道中产生的CPE被吸收到血液中，然后损害肝脏、心脏和肾脏等器官时，F型肠道感染可进一步发展为致命的肠毒血症[12,13]。
本研究主要分析2022年某高级中学一起由产气荚膜梭菌引起的食物中毒事件的病原学特征，并对传统检测方法进行改进和优化，为今后产气荚膜梭菌以及其它细菌导致的食物中毒事件实验室检测提供新的思路和方向。
1 材料和方法
1.1材料
1.1 .1流行病学调查资料
2022年11月27日18:51分，接到一起高级中学多人就餐后出现身体不适的情况报告。据调查，该事件发生在该中学食堂，11月27日中午大约有800余人就餐，午餐为肉夹馍、蒜黄炒肉片、清炒奶白菜、西红柿鸡蛋汤、馒头、米饭。11月27日下午陆续有学生出现腹泻呕吐症状。11月27日18:51分，该中学向相关部门进行了情况报告，并将症状较重的5名学生送医就诊，诊断为急性胃肠炎。有21名学生症状较轻，无重症病例，体征情绪均稳定。
1.1.2 标本采集
采集了12名学生肛拭子、10份环境涂抹标本、1份肉夹馍、1份蒜黄炒肉片、1份清炒奶白菜、1份西红柿鸡蛋汤、1份馒头、1份米饭等6份食品标本。
1.1.3 主要试剂和仪器
细菌DNA提取试剂盒、食源性致病菌核酸多重实时荧光PCR检测试剂盒、产气荚膜梭菌ε毒素(etx)基因实时荧光PCR检测试剂盒、产气荚膜梭菌α毒素(plc)基因实时荧光PCR检测试剂盒、产气荚膜梭菌ß毒素(cpb)基因实时荧光PCR检测试剂盒、产气荚膜梭菌ι毒素(Ia) 基因实时荧光PCR检测试剂盒、产气荚膜梭菌β2 毒素(cpb2)基因实时荧光 PCR 检测试剂盒、产气荚膜梭菌CPE基因实时荧光PCR检测试剂盒等试剂盒均购自卓诚惠生公司；产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)购自广州达安生物科技有限公司、含225 m 0.1%蛋白陈水均质袋、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂、D-环 丝氨 酸 溶 液、液体硫乙醇酸盐培养基管(FTG)、含铁牛乳培养基等均购自青岛海博有限公司。SLAN965 上海宏石荧光定量PCR仪。Autof MS2000质谱仪。
1.2检测方法
1.2.1 多重实时荧光PCR 进行初筛
标本提取核酸后利用食源性致病菌核酸多重实时荧光PCR检测试剂盒快速筛查识别病原菌。检测内容包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157、单核细胞增生李斯特氏菌、坂崎肠杆菌、小肠结肠耶尔森氏菌、弧菌属、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌、气单胞菌属、产气荚膜梭菌和弯曲菌属。PCR反应条件：95℃
5min；95℃15s，60℃45s(采集荧光)，共循环40 次。
1.2.2 初筛结果利用荧光PCR进行确证
将多重实时荧光PCR初筛为产气荚膜梭菌的标本进一步用产气荚膜梭菌检测试剂盒进一步确证。PCR反应条件：50℃ 2min；95℃ 15min；94℃15s，55℃45s(采集荧光)，共循环40 次。
1.2.3 进行毒力基因核酸检测
利用产气荚膜梭菌ε毒素、α毒素、ß毒素、ι毒素、β2 毒素以及CPE基因检测试剂盒进行毒素检测。PCR反应条件： 95℃ 5min；95℃15s，60℃45s(采集荧光)，共循环40 次。
1.2.4 分离培养和菌种鉴定
将食品标本按照 GB4789.13－2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》进行产气荚膜梭菌的分离培养。将粪便用生理盐水稀释1：10，1：100后浇注TSA培养基，并覆盖一层TSA，置厌氧环境进行培养。从单个平板上任选5个黑色菌落，分别接种到 FTG 培养基，36℃±1℃培养 24h后接种于含铁牛乳培养基进行“暴烈发酵”试验、穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基、乳糖-明胶培养基等生化实验进行证实。 同时将单个菌落接种血平板进行鉴定，接种营养琼脂进行质谱分析。
1.2.5 PFGE 分子分型
参照国际食源性致病菌病原细菌分子分型监测网络 PulseNet 中产气荚膜梭菌 PFGE 分型的标准操作方法，使用 SmaⅠ作为限制性内切酶，30℃ 酶切4h； 电泳参数为0.5～40s， 电泳时间为 19h；沙门氏菌H9812作为分子质量标准，使用 XbaⅠ作为限制性内切酶，将 PFGE 图像录入 BioNumerics7.6 软件进行处理分析。
1.2.6 其它致病菌检测
标本除了进行产气荚膜梭菌分离培养外，还按照《常见细菌性食物中毒快速处置》分别对粪便标本、食品标本和外环境标本进行五种致泻性大肠埃希菌、志贺菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、单胞菌的分离培养。
2 结果
2.1多重实时荧光PCR 进行初筛以及再次确认结果
食源性致病菌核酸多重实时荧光PCR 检测结果显示12份粪便标本中检出产气荚膜梭菌核酸阳性10份。食品肉夹馍标本中检出产气荚膜梭菌核酸阳性1份；其它食品标本和环境标本未检出相关病原菌核酸。上述标本利用产气荚膜梭菌核酸检测试剂盒再次确认，均为产气荚膜梭菌核酸阳性。
2.2 产气荚膜梭菌6类毒素基因核酸检测结果
10份粪便标本和1份食品肉夹馍标本中产气荚膜梭菌α毒素(plc基因)和CPE基因均为阳性。
2.3 平板计数和生化确证结果
1份食品肉夹馍标本中产气荚膜梭菌结果为6.5 x 103 CFU/g；10份粪便标本中产气荚膜梭菌结果为6.6 x 106 CFU/g、3.2 x 107 CFU/g、8.3 x 106 CFU/g、5.3 x 106 CFU/g、2.6 x 107 CFU/g、2.7 x 106 CFU/g、3.9 x 106 CFU/g、7.4 x 107 CFU/g、8.7 x 106 CFU/g、1.6 x 107 CFU/g；1份食品肉夹馍标本和10份粪便标本培养菌落经飞行质谱仪鉴定为产气荚膜梭菌，可信度均在90%以上；同时含铁牛乳“暴烈发酵”试验以及发酵乳糖、液化明胶、还原硝酸盐、动力试验以及在血平板上均形成双层溶血环(见图1)等均符合产气荚膜梭菌的特征。
2.4 PFGE 分子分型结果
10份粪便标本和1份肉夹馍标本中检出产气荚膜梭菌DNA通过 XbaⅠ限制性内切酶酶切后进行PFGE分子分型检测，并将图谱使用 BioNumerics7.6 软件进行聚类分析发现菌株条带图谱完全一致，相似度为100% ，结果见见图2。
1-10号为粪便标本，11号为食品标本
图2. 11 株产气荚膜梭菌 PFGE 聚类分析结果
Figure2. PFGEclusteranalysisofeleven Clostridiumperfringen
2.5其他致病菌培养法检测结果
28份标本经过常规培养方法的鉴定，均未检出五种致泻性大肠埃希菌、志贺菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、单胞菌。
3讨论
产气荚膜梭菌在自然界分布广泛存在，在土壤、污水、垃圾、家畜、昆虫及人的粪便中都可检出。动物的带菌率因其种类不同而异，大约在10%-40%左右。土壤和污水中本菌的检出率为3%-10%。健康人肠道带菌率低者为2%-5%，高者可达15-25% [14]。 本次食物中毒事件中，患者粪便的检出率为(10/12)80%，带菌率远远大于正常人群的最高带菌率。
产气荚膜梭菌通常作为污染物存在于肉类和家禽产品中，也存在于蔬菜和作物中。当产气荚膜梭菌在被污染的食品上大量繁殖，大量的活菌随同食品被食入后，在小肠内形成芽孢，同时产生CPE，引起食物中毒。F型产气荚膜引起的食物中毒，主要由其产生CPE所致。李红新登在调查北京市顺义区健康人群携带产气荚膜梭菌的生物特征中得出，分离的56株产气荚膜梭菌阳性毒株中CPE毒力基因未检出[15]。本次检测的13份标本中有11份CPE和α毒素基因结果为阳性，检出率为84.62%。尤其食品中检测出CPE和α毒素基因，为本次食物中毒是确定是有F型产气荚膜梭菌引起提供了理论依据。本次检测结果显示，肉夹馍分离培养时，菌落总数没有超过1x106 ，但是肉夹馍中检测出毒力基因，以及经PFGE比对分析，证实肉夹馍中得到的产气荚膜梭菌和粪便中的分离的产气荚膜梭菌PFGE图谱相似度100%，通过相关性分析，又一次证明此起食物中毒主要是由学生食用被F型产气荚膜梭菌污染的肉夹馍导致。分析本次食物中毒原因，主要为F型产气荚膜梭菌芽孢污染的肉，虽经烹制加热，但因芽孢耐热，当受到“热刺激”时，促进其发芽，并在较高温度长时间储存过程中，芽孢发芽形成大量的繁殖体并生长、繁殖随食物进入肠道的繁殖体在肠道中容易再形成芽孢，同时产生CPE对机体致病。由此可见，对食堂从业人员进行加强培训，使其充分了解并掌握食品加工烹饪及储存过程的各个环节，保证食品的安全和提高食品的品质。
产气荚膜梭菌在自然界广泛存在， 健康人体带菌，所以发生食物中毒，或者实验室检测出产气荚膜梭菌时，很难最后确定是由此菌引起的，大都概括为不明原因引起的食物中毒，这样对相关部门不能起到警示的作用，不能有效地预防。
国内文献中报道的关于产气荚膜引起的食物中毒较少，部分文献主要从流行病学和临床症状进行分析和讨论，实验室对产气荚膜梭菌的处理，都是参考 WS/T7－1996《产气荚膜梭菌食物中毒诊断标准及处理原则》[16]。产气荚膜梭菌经典的培养、生化鉴定、以及CPE的检测方法存在着检测周期长、步骤繁琐等缺点。在处理食物中毒事件中，不能及时提供实验室检测依据[17]。随着分子生物学技术的发展，多重实时荧光PCR 检测方法能同时检测多种细菌，具有重复性好，特异性强等特点，而且可以直接从加热后的食品、粪便中进行检测，具有迅速、敏感以及准确等特点。如果应用在处理食物中毒事件中，可缩减致病因子的筛查范围，防止漏检，同时减少对实验物质和标本的浪费。对样进行毒力基因的检测以及进行PFGE指纹图谱进行聚类分析能很好的进行病因的关联。为相关部分处理食物中毒事件提供可靠的理论依据。
综上所述，本次食物中毒从病人的带菌率、毒素、培养物的生化实验以及菌株进行PFGE试验等方面进行确证，节约了大量时间，准确及时地给相关部门提供了可靠的实验室依据。产气荚膜梭菌引起的食物中毒有明显季节性，以夏、秋季为主[11]。但是这起食物中毒发生在初冬季节，和以往的季节性食物中毒相比，明显有一定的变化，主要原因为有的地区气候温暖潮湿，初冬温度仍然适合产气荚膜梭菌生长繁殖。
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