国产和进口蜂蜜中嗜渗酵母的检出调查和菌种鉴定[ ]

袁家鑫1，王胤臻1，阎贺静1，肖艳霞2，张玉梅2，王海洋2，柳吉芹2， 高飞2，崔宗岩2，钱云开2

(1.河北科技师范学院食品科技学院，秦皇岛 066612；2.秦皇岛海关技术中心，秦皇岛 066004)

摘  要：目的  对国内外蜂蜜中嗜渗酵母进行检测，并对其中部分样品中分离到的菌株进行种属鉴定和特性试验。方法  选取916批国产和进口的蜂蜜，根据GB 14963—2011《食品安全国家标准 蜂蜜》和GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的规定对所试验的蜂蜜样品进行嗜渗酵母计数，并计算出嗜渗酵母检出率。对分离菌株经26S rDNA PCR扩增，进行测序和序列比对分析，确定属种。通过吸光度法和重铬酸钾比色法对部分分离酵母菌株的耐高糖和产酒精能力进行检测。结果  在916批次蜂蜜中，共检出嗜渗酵母36批，检出率为3.93%；其中国产蜜786批，共检出嗜渗酵母33批，检出率为4.20%，嗜渗酵母计数为2.5×102〜7×104 CFU/g；进口蜜130批，共检出嗜渗酵母3批，检出率为2.31%，嗜渗酵母计数为1×101〜7×101 CFU/g。分离得到5株嗜渗酵母，1株为假霉蚜虫酵母(Moesziomyces aphidis/Pseudozyma sp., M.aphidis)，3株为蜂蜜接合酵母(Zygosaccharomyces mellis, Z. mellis)，1株为木兰假丝酵母(Candida magnoliae, C.magnoliae)，所试验菌株对高浓度糖耐受性良好并且全都有一定的产酒精能力。结论  蜂蜜存在着被嗜渗酵母污染的可能，需要加强对它的控制和管理；蜂蜜可以作为筛选耐渗透压菌种的来源，选育蜂蜜嗜渗酵母有助于蜂蜜食品发酵工业的发展和优秀产品的研发。

关键词：蜂蜜；嗜渗酵母；菌种鉴定；耐高糖

Detection and strain identification of osmophilic yeast in domestic and imported honey

YUAN Jiaxin1,WANG Yinzhen 1,YAN Hejing1,XIAO Yanxia2,ZHANG Yumei2,WANG Haiyang2,LIU Jiqin2,GAO Fei2,CUI Zongyan2,QIAN Yunkai2

(College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066612, China; 2. Qinhuangdao Customs Technical Center, Qinhuangdao 066004, China)

Abstract: Objective  Osmophilic yeast in honey at home and abroad was detected, and the strains isolated from some samples were identified and their characteristics tested.  Methods  Selected 916 batches of domestic and imported honey, according to GB 14963-2011 "National Standard for Food Safety Honey" and GB 4789.2-2022 "National Standard for Food Safety Food Microbiology Inspection total colony determination", the osmophilic yeast count of the tested honey samples was carried out, and the detection rate of osmophilic yeast was calculated. The isolated strains were amplified by 26S rDNA PCR, and the sequences were sequenced and compared to determine the species. The high sugar tolerance and alcohol production capacity of some yeast strains were tested by absorbance method and potassium dichromate colorimetric method. Results  In 916 batches of honey, 36 batches of osmophilic yeast were detected, and the detection rate was 3.93%. Among 786 batches of domestic honey, 33 batches of osmophilic yeast were detected, the detection rate was 4.20%, and the osmophilic yeast count was 2.5×102 ~ 7×104CFU/g. In 130 batches of imported honey, 3 batches of osmophilic yeast were detected, the detection rate was 2.31%, and the osmophilic yeast count was 1×101 ~ 7×101CFU/g. Five osmophilic yeast strains were isolated, one was Moesziomyces aphidis/Pseudozyma sp., and three were Zygosaccharomyces mellis. One was Candida magnoliae, and all of the tested strains were well tolerant to high glucose concentrations and had some capacity to produce alcohol. Conclusion  Honey may be contaminated by osmophilic yeast, so it is necessary to strengthen its control and management. Honey can be used as a source for screening osmolal-resistant strains, and the selection of osmophilic yeast is helpful to the development of honey food fermentation industry and the research and development of excellent products.

Key words: Honey; Osmophilic yeast; Strain identification; High glucose tolerance

蜂蜜是一种天然的营养食品，是从昆虫中获取的少数传统食品之一。它是蜜蜂通过采集植物的花粉或者分泌物结合蜜蜂自身产生物质而形成的一种甜味物质。从花蜜到蜂蜜的转化过程中，蜂蜜会与各种微生物接触，有产蜜的植物携带微生物、蜂肠道微生物以及蜂巢环境微生物等[1-2]。由于蜂蜜具有较低的水分活度、较高的渗透压，以及低pH和抗菌化合物的存在能够抑制微生物的生长繁殖，使得蜂蜜中的微生物是有限的[3]。一般适宜微生物生长的渗透压为 3.001×106 〜6.001×106 Pa, 而蜂蜜的渗透压约1.050×107 Pa[4]。部分微生物能够耐受蜂蜜的高糖环境，嗜渗酵母是其中的主要微生物之一。嗜渗酵母是一类能够在自然或者人为高渗透压条件下正常生长繁殖的酵母,在以往的研究中，有多种嗜渗酵母从蜂蜜中分离纯化出来，在德国和匈牙利蜂巢和蜂蜜中分离的8株八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)和5株未被描述的酵母菌株，该新种属于接合酵母(Zygosaccharomyces)分支，所有的分离株都表现出明显的嗜渗特性[5-6]。目前，经报导的从蜂蜜中分离的酵母达到20余种[6-8]。

在以往对蜂蜜的研究中，主要是对其物化性质以及特殊成分和功能进行探索，有关于蜂蜜微生物及嗜渗酵母研究较少。本研究对2020～2023年内实验室收集的国产蜜和进口蜜共916批进行嗜渗酵母检出率统计，样品来源涵盖了国产蜂蜜的主要产区和主要进口国家，蜂蜜样品量大并且种类丰富，具有重要统计学意义；同时从中分离纯化嗜渗酵母，采用26S rDNA测序对所分离嗜渗酵母进行分子生物学鉴定，并对分离嗜渗酵母的高糖耐受性及产酒精能力进行测定。一方面，对蜂蜜嗜渗酵母的污染情况进行摸底，为后续蜂蜜安全性生产、贮存等方面提供理论依据，同时也为嗜渗酵母在食品发酵产品的研究和生物工程开发微生物资源提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 蜂蜜样品

从秦皇岛海关技术中心保存的蜂蜜样品中选取国产和进口蜂蜜916批，具体信息如下：大洋洲78批(新西兰、澳大利亚)；欧洲37批(德国、比利时、俄罗斯、意大利)；亚洲796批(中国786批、泰国、日本、韩国)和北美洲5批(美国、加拿大)。其中包括一些特色蜜如麦卢卡、康蜜乐、红柳桉、及国内洋槐蜜、枣花蜜等。

1.1.2 试剂

葡萄糖(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；甘油(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；酵母基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)；酵母通用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAAAAAG -3′;NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3′[9](北京擎科生物科技股份有限公司)；Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；2%重铬酸钾溶液(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；浓硫酸(分析纯，天津凯信化学工业有限公司)；无水乙醇溶液(色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)

1.1.3 培养基

氯硝胺18%甘油(DG18)培养基(g/L)：酪蛋白胨5.0；无水葡萄糖10.0； 磷酸二氢钾1.0；硫酸镁(MgSO4·H2O)0.5；氯硝胺0.002；琼脂15；氯霉素0.1(北京陆桥技术股份有限公司)

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基(g/L)：葡萄糖20.0；酵母浸出粉5.0；蛋白胨10.0；琼脂14.0(北京陆桥技术股份有限公司)

葡萄糖浓度为300、450、600、750、900 g /L的 YPD培养基。

1.2 仪器与设备

TD5002C电子天平(精密度0.01g；天津天马衡基仪器有限公司)；BHC-1300IIAZ生物安全柜(苏州苏洁医疗器械有限公司)；YCP-50生化恒温培养箱(长沙华曦电子科技有限公司)；DM3000生物显微镜(德国徕卡仪器有限公司)；PCR-9700 PCR仪(上海赛默飞世尔科技有限公司)；Biospec-mini型紫外分光光度计(日本岛津公司)；Multifuge X3R高速冷冻离心机(上海赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 嗜渗酵母的分离纯化

取蜂蜜样品25 g加入225 mL 30%葡萄糖溶液中，充分振荡混匀，制成1：10的均匀稀释液，移液枪吸取1 mL加入9 mL葡萄糖溶液中，充分混匀制成1：100均匀稀释液；将不同浓度稀释液各取100 μL涂布于DG18培养基，28℃培养7-10 d。挑选具有典型酵母特征的单菌落在YPD培养基上多次划线，进行分离纯化，在光学显微镜下观察酵母形态，确定无杂菌后接种于YPD斜面培养基28℃培养3 d后于4℃保存备用。典型的嗜渗酵母在DG18培养基上呈现为圆形、中心隆起、不透明、边缘整齐的菌落，直径1 mm～2 mm。

1.3.2 嗜渗酵母检出率

根据GB 14963—2011《食品安全国家标准 蜂蜜》和GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的规定对所试验蜂蜜样品进行嗜渗酵母计数，并计算出嗜渗酵母检出率。

1.3.3 嗜渗酵母DNA的提取

将分离纯化的待鉴定酵母菌株重新接种至YPD培养基培养3 d，挑取单菌落，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母DNA。

1.3.4 26S rDNA PCR扩增

选用酵母菌通用引物26S rDNA NL1-NL4进行PCR扩增。

PCR扩增体系(50 μL)：Taq DNA聚合酶25 μL，引物NL1 2 μL，引物NL4 2 μL，DNA 4 μL，灭菌蒸馏水17 μL。

PCR反应程序：94℃预变性4 min，94℃变性1 min，55℃退火40 s，72℃延申90 s,共35个循环，72℃延申10 min。

将PCR产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。获得的基因序列在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的 GenBank数据库中进行BLAST序列比对，并用MEGA软件构建系统发育树。

1.3.5 嗜渗酵母高糖耐受性试验

将实验菌株在YPD培养基中活化三代，并将对数生长期的菌株(600 nm处的吸光度达到0.6-0.8)按3%的接种量，分别接种于起始葡萄糖浓度为 300、450、600、750、900 g /L的YPD液体培养基，pH5.0，于 28 ℃，150 r/min 条件下恒温培养3 d，测定600 nm处的吸光度值，实验重复3次并绘制菌株葡萄糖耐受性曲线。

1.3.6 嗜渗酵母产酒精试验

将活化菌株以3%(V/V)的接种量接种于YPD液体培养基中，置于28℃发酵3 d，以酿酒酵母为对照菌株，采用重铬酸钾比色法测定产乙醇能力。根据下表乙醇标准曲线反应体系(表1)，向各管中加1 mL 2%重铬酸钾溶液，5 mL浓硫酸，摇匀，静置2 h。以未加浓硫酸的混合液为空白对照，测定反应液在600 nm的吸光度。以乙醇体积为横坐标、反应液OD600为纵坐标，绘制乙醇标准曲线，得出回归方程。取72 h发酵液1.5 mL，7000 r/min离心5 min，取0.5 mL上清液稀释适当倍数，按照上述方法测定OD600，根据回归方程算出样品中的酒精含量。

表1 乙醇标准曲线反应体系

Table 1 Ethanol standard curve reaction system

1.4 统计学分析

     使用Excel 2021软件对试验数据进行处理，绘制折线图和标准曲线；实验重复3次，使用 SPSS 24.0 软件通过AONVA分析和邓肯检验进行统计学分析, 并检验其显著性, P<0.05为不同组之间差异显著。

2 结果

2.1 嗜渗酵母分离株菌落形态

选取5株从DG18平板上分离的酵母，分别划线接种至YPD平板上培养72 h后(图1)，可见单菌落出现，表面光滑湿润，颜色为乳白色不透明，边缘整齐，中心突起，易挑起，符合酵母的菌落特征。

A              B             C             D

注：A、B为DG18培养基；C、D为YPD培养基上菌株221和644的菌落形态

图1  嗜渗酵母在DG18、YPD培养基上的菌落形态

Fig.1  Colony morphology of osmophilic yeast on DG18 and YPD media

2.2 国内外蜂蜜产品嗜渗酵母检出率

在916批次蜂蜜中，共检出嗜渗酵母的蜂蜜有36批次，检出率为3.93%。

其中国产蜜786批次，共检出嗜渗酵母33批次，检出率为4.2%，嗜渗酵母计数为2.5×102〜7×104 CFU/g；进口蜜130批次，共检出嗜渗酵母3批次，检出率为2.31%，嗜渗酵母计数为1×101〜7×101 CFU/g。

2.3 嗜渗酵母分离株的分子鉴定及系统进化树分析

采用BLAST工具对所得序列进行比对，并通过Mega软件——NJ法构建系统进化树，系统进化树表明，菌株221与假霉属(Pseudozyma sp.)等聚于同一个分支，亲缘关系最近(图2)，菌株3301、3303和3601来源于同一支(图2)，菌株644与木兰假丝酵母同源性最高，结合BLAST结果来看(表2)，可以确定菌株221为假霉蚜虫酵母(Moesziomycesaphidis/Pseudozyma sp., M.aphidis)、菌株3301、3303、3601为蜂蜜接合酵母(Zygosaccharomycesmellis, Z. mellis)，菌株644为木兰假丝酵母(Candida magnoliae, C.magnoliae)。M.aphidis是一种环境酵母，通常存在于植物的叶子、土壤和花朵中，也可以作为环境病原体[10]。2013年Takashi等人报道了在血液中首次分离到假酶类菌作为人类病原体[11]。Sujinan[8]等人从泰国原生蜂蜜中分离出的Z. mellis具有极强的渗透耐受性，能够造成高糖食品的腐败。C.magnoliae被研究作为一种耐渗透压酵母，并且可以还原糖而产生赤藓糖醇[12]。

图2  基于26S rDNA基因序列菌株221、3301、3303、3601、644系统进化树

Fig.2  Phylogenetic tree of strains 221, 3301, 3303, 3601, 644 based on 26SrDNA gene sequence

表2  分离菌株与Genbank参考菌株比对结果

Table 2  Results of comparison between isolated strains and Genbank reference strains

2.4 嗜渗酵母高糖耐受性

选取4株嗜渗酵母分离株(221、3301、3601、644)进行高糖耐受性试验。分别改变YPD培养基中葡萄糖浓度(300、450、600、750、900 g /L)，试验结果显示(图3)，4株试验菌株均能在高糖条件中存活和生长，生长量随着葡萄糖浓度的增大而降低，不同嗜渗酵母表现出不同的高糖耐受性。菌株644高糖耐受性最好，在300〜750 g/L葡萄糖浓度时生长均优于其他菌株，菌株3301和3302次之，菌株221生长最差。但2株Z. mellis在900 g/L葡萄糖浓度下生长情况优于其他菌株。

图3  嗜渗酵母高糖耐受性曲线

Fig.3  Hyperglucose tolerance curve of osmophilic yeast

2.5 嗜渗酵母产酒精含量

采用重铬酸钾比色法绘制乙醇标准曲线，所得的回归方程为y=0.0776x+0.004 R2=0.9907，根据回归方程计算的出72 h酵母发酵母中酒精含量。从酒精产率结果来看(表3)，从蜂蜜中分离得到的4株嗜渗酵母都有一定的产酒精能力，酒精产率均达到6%左右。

表3  嗜渗酵母产酒精含量

Table 3  Osmophilic yeast produces alcohol content

注: 同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

嗜渗酵母作为一类能够在自然或者人为高渗透压条件下正常生长繁殖的酵母，其生存能

力较强，且很难在早期检测到，当温度适宜并且蜂蜜水分含量超过33%时，嗜渗酵母会大量繁殖并且使蜂蜜发酵[13]，导致蜂蜜腐败变质，产生气泡和酒味。不仅降低了蜂蜜的品质和价值，还会给企业造成一定经济损失,对国际贸易也会产生负面影响[14-15]。国际食品法典委员会标准要求蜂蜜在贮存、销售及运输过程中不得发酵或发生风味变化。因此，嗜渗酵母被列为蜂蜜需要控制的主要腐败菌之一，也是近十年来被各国列为蜂蜜进出口检验的重要检测指标[16]。GB 14963—2011《食品安全国家标准 蜂蜜》提出有关于嗜渗酵母的检验方法，在微生物限量中明确指出嗜渗酵母计数应不得超过200 CFU/g。本研究通过对916批次国内外不同地域和不同种类蜂蜜进行嗜渗酵母的计数，结果显示共检出嗜渗酵母36批次，嗜渗酵母的检出率为3.93%。其中国内4.2%，国外2.31%，可见嗜渗酵母检出率较高，所检国内外蜂蜜产品均存在着较大的被嗜渗酵母污染的可能，嗜渗酵母的检测对于蜂蜜也显得尤为重要。嗜渗酵母与菌落总数和霉菌计数作为蜂蜜中常见的微生物指标不合格因素，应该作为重要的风险因素进行重点关注与控制研究。

虽然嗜渗酵母的存在对蜂蜜的感官和品质具有潜在的不良影响[17]，但嗜渗酵母可用于蜂蜜酒[18]、蜂蜜醋[19]以及相关产品的研究和开发，从食品工业的角度来看具有一定的积极作用。

本研究通过对嗜渗酵母分离株进行高糖耐受性和产酒精试验发现，4株试验菌株均能在900 g/L高糖条件中存活和生长，高糖耐受性的优良是决定酵母能否在高渗环境中产生作用的首要因素，徐伟[20]等人在东北黑蜂椴树蜜中分离出1株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，可在800 g/L葡萄糖培养基中生长。刘功良曾在蜂蜜中分离筛选出6株Z. mellis并对其高唐耐受性进行试验，结果表明Z. mellis糖耐受性可达到500〜700 g/L[21]，本研究中Z. mellis糖耐受性可达900 g/L甚至更高。有研究表明，在高渗环境下酵母菌自身存在的系统会出现几种信号传导途径和分子机制应答[22]，通过在细胞内快速累积一些与高渗特性相关的小分子物质，如甘油[23]、海藻糖[24]和糖醇[25]等来调节胞内外压力的平衡，从而对渗透压进行调节，以适应在高渗环境中的生长。这种调节系统的表达方式和强弱程度不同，因此酵母对外界环境表现出的耐渗性也有明显差异。同时从蜂蜜中分离得到的4株嗜渗酵母都有一定的产酒精能力，酒精产率均达到6%左右。虽然嗜渗酵母的存在会使蜂蜜产生腐败变质的可能，但在高渗透压环境下，嗜渗酵母有利于食品发酵和工业生产乙醇。有研究表明，在孟加拉国蜂蜜分离出的8株嗜渗酵母中，其中5株有较高的发酵能力，并且1株的发酵效率最高，乙醇产量达到33.48% (v/v)[26]，该株菌可用于增加乙醇的生产，因此蜂蜜可以作为酵母工业应用中有价值的潜在新来源[27]。

本研究通过对国内外不同地域和不同种类蜂蜜进行嗜渗酵母的计数、分离鉴定以及耐高糖和产酒精试验，为国内外蜂蜜污染嗜渗酵母的情况提供了参考数据，表明嗜渗酵母存在污染蜂蜜造成其腐败变质的风险。因此，需要加强对蜂蜜中嗜渗酵母的控制和管理，增加嗜渗酵母的检测频率和除菌工艺，提升蜂蜜品质。同时，也表明蜂蜜可以作为筛选耐渗透压菌种的来源，选育蜂蜜嗜渗酵母有助于蜂蜜食品发酵工业的发展和优秀产品的研发。国内有关于嗜渗酵母的报导较少，对嗜渗酵母相关特性还有待进一步的研究。

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