蛋黄的颜色是禽类日常摄入的类胡萝卜素和叶黄素等脂溶性色素在卵形成期间沉积到蛋黄中形成的，禽类自身没有合成这些色素的能力。正常情况下，禽蛋的蛋黄会显示出从黄色到橙色甚至红色的色泽。随着饲养管理技术的提高，动物生长速度快，饲养周期短，导致动物产品中色素的自然沉积降低，达不到健康和自然生长条件下的色泽^［1］。而消费者选购禽蛋时，常常认为蛋黄金黄色或红棕色就是“土鸡蛋”、“土鸭蛋”，营养价值会更好；因此，为了改善动物产品的色泽，饲料着色剂加丽素红、加丽素黄被广泛应用在我国蛋禽饲料和其他家禽饲料中。不法商贩将着色剂超量饲喂家禽，生产蛋黄颜色鲜艳的“红心蛋”事件时有发生。
        加丽素红、加丽素黄分别为10% β,β-胡萝卜素-4,4-二酮（又称斑蝥黄、角黄素）和10% β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯的粉剂。农业部2045号公告《饲料添加剂品种目录》^［2］规定，斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯允许添加在家禽饲料中。联合国粮农组织/世卫组织的食品添加剂联合专家委员会（JECFA）制定的斑蝥黄可接受每日摄取量最大允许值为0.03 mg/kg BW^［3］。日本“肯定列表制度”规定^［4］：禽蛋和猪、牛、水产品等动物源性食品中斑蝥黄最大残留限量为0.1 mg/kg。我国对动物源性食品中斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯最大残留限量并无规定。
        饲料添加剂及饲料中斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯检测方法主要有紫外-可见分光光度法^［5-6］、高效液相色谱法^［7］等。禽蛋中斑蝥黄残留检测方法多为高效液相色谱法^［8-11］和液相色谱-质谱法^［12-14］，动物源食品中β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯残留检测鲜见报道。本试验在总结文献基础上，建立超高效液相色谱-串联质谱法测定禽蛋中的斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯，该方法简便、灵敏、快速，结果稳定可靠，适合于食品风险监测和了解加丽素红、加丽素黄在禽蛋中的残留情况，为消费者健康食用禽蛋提供一定的科学依据，对保护消费者权益具有现实意义。
        从农贸市场和大型超市采集的鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋样品共30份。
        Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQ MS串联质谱仪、Sep-Pak Silica固相萃取柱（200 mg，3 ml）均购自美国Waters，Milli-Q超纯水器，均质器，涡旋混合器，超声波清洗器，高速冷冻离心机，旋转蒸发仪，MTN-2800W多位氮气浓缩仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
        斑蝥黄（CAS：514-78-3，纯度98.3%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH），加丽素红（10% β,β-胡萝卜素-4,4-二酮）、加丽素黄（10% β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯）均购自法国DSM Nutritional Products France SAS，丙酮、乙腈、正己烷、三氯甲烷、甲酸均为色谱纯，无水硫酸钠、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）均为分析纯，试验用水为超纯水。
        按照GB/T 18970—2003《饲料添加剂 10% β,β-胡萝卜素-4,4-二酮（10%斑蝥黄）》^［5］及GB/T 21516—2008《饲料添加剂 10% β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯（粉剂）》^［6］方法，测定购买的加丽素红、加丽素黄中斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯的含量。
        斑蝥黄对照储备液配制：精密称取斑蝥黄对照品0.01 g，加入0.1 g BHT，用甲醇-三氯甲烷（9∶1，V/V）溶解并定容至100 ml，浓度为100 μg/ml，-20 ℃保存。
        斑蝥黄对照系列溶液配制：临用时，取配制的斑蝥黄对照储备液，用含0.1%甲酸的乙腈稀释制成5、20、50、100、200、1 000 ng/ml的系列溶液。
        混合工作对照储备液配制：临用新制。精密称取加丽素红、加丽素黄各0.01 g置25 ml容量瓶中，加入0.1 g BHT，加1 ml 60 ℃水，超声5 min后，加15 ml甲醇与2 ml三氯甲烷，继续超声5 min，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm尼龙微孔滤膜，取续滤液即得。斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯的浓度均为40 μg/ml。
        混合系列工作对照溶液配制：临用时，取配制的混合工作对照储备液，用含0.1%甲酸的乙腈稀释制成含斑蝥黄和β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯分别为5、20、50、100、200、1 000 ng/ml的系列溶液。
        禽蛋去壳后均质，取1.0 g样品于50 ml离心管中，加入0.1 g BHT和1 ml丙酮，涡旋30 s，加入20 ml乙腈，涡旋1 min，超声（250 W，53 kHz）30 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，加10 ml乙腈饱和的正己烷涡旋1 min，静置分层后弃去上层正己烷层，下层溶液用5 g无水硫酸钠脱水后于40 ℃减压蒸干。取Silica固相萃取柱（200 mg，3 ml），用3 ml正己烷-丙酮（9∶1，V/V）活化，残渣加2 ml正己烷使溶解后将其转至Silica固相萃取柱顶部，收集流出液，用6 ml正己烷-丙酮（9∶1，V/V）洗脱，合并流出液，于40 ℃下氮气吹至近干。用1 ml含0.1%甲酸的乙腈溶解残渣，过0.22 μm尼龙微孔滤膜，滤液待分析。如样品溶液中目标物含量过高（超出标准曲线范围），应酌情稀释。
        色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；进样量1 μl；流速0.3 ml/min；流动相A为0.1%甲酸，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脱条件见表1。在上述色谱条件下，斑蝥黄反式、顺式异构体保留时间分别为1.52、1.72 min，β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯保留时间为2.28 min。斑蝥黄的量以顺、反式异构体总量计。
        如果样品溶液与标准曲线溶液检出的色谱峰保留时间一致，并在扣除背景后的样品色谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，其相对偏差在以下范围内可以定性确认为与标准物质一致（相对丰度＞50%时，相对偏差≤20%；相对丰度为20%～50%时，相对偏差≤25%；相对丰度为10%～20%时，相对偏差≤30%；相对丰度＜10%时，相对偏差≤50%）。用混合系列工作对照溶液进行定量。
        本试验在国内外对照品供应商处均未能购买到β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯（CAS：1109-11-1）对照品，只能采用加丽素黄（按1.2.1折算含量后）作为β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯工作对照品。
        采用加丽素红（折算含量后）作为斑蝥黄工作对照品（标准曲线斜率391.567），与直接采用斑蝥黄对照品（标准曲线斜率409.862）测定结果基本一致（斜率之比＞95%）。
        现有的行业标准和相关文献中，禽蛋中斑蝥黄残留检测前处理一般采用两种方式，一是煮熟禽蛋后提取^［10,14］，二是生蛋黄冷冻干燥后提取^［8］。这两种方式都有不足，前者加热过程会引起类胡萝卜素的降低^［11］，后者方法比较繁琐，增加了前处理时间可能引起目标物的降解；因此，本试验采取禽蛋去壳后均质直接使用。
        禽蛋中含丰富的蛋白质、脂肪、维生素及矿物质，选用丙酮作为蛋白变性剂，BHT作为抗氧剂，采用乙腈提取，可以排除蛋白质及矿物质干扰。禽蛋中的脂肪主要是胆固醇与磷脂，正己烷脱脂和Silica固相萃取柱的两步净化可以较好的除去脂类干扰，利于目标物的分离与离子化。
        根据化合物性质及文献^［12-14］报道，分别在正、负离子模式下考察目标物响应。结果表明，斑蝥黄在正离子模式下［M+H］⁺响应非常强，β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯在正、负离子模式下响应都较弱。分析原因，可能是斑蝥黄含有两个羰基，易在正离子模式下电离，而β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯为中性分子，不易电离；因此本试验在流动相中加入适量甲酸，并增加β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯驻留时间来提高其在正离子模式下的响应。
        取阴性样品1.0 g，分别加入不同体积的20 ng/ml混合工作对照溶液制备成浓度为1、2、10、20 μg/kg的加标样品，涡旋混匀，避光静置30 min使其接触充分，按1.2.3样品前处理法制备。以信噪比（S/N）≥3时的检出浓度作为检测限（LOD），以S/N≥10时的检出浓度作为定量限（LOQ）。结果表明，斑蝥黄LOQ远小于日本肯定列表0.1 mg/kg的限度要求。斑蝥黄、β-阿朴-8’-胡萝卜素酸乙酯在线性范围内，峰面积与检测浓度之间的线性关系良好，见表3。2种分析物的MRM图见图1。
        称取同一来源的阴性样品15份，每份1.0 g，分 别添加混合工作对照溶液，制成低、中、高3种浓度水平的加标样品各5份，按1.2.3样品前处理法制备后带入标准曲线计算。结果表明本方法重复性与回收率均较好，结果见表4。 
        按照本试验方法对30份禽蛋样品进行2种饲料着色剂残留测定，结果见表5。结果表明本方法
        本试验采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了禽蛋中2种饲料着色剂检测方法，样品前处理采用乙腈提取，正己烷脱脂和固相萃取两步净化，方法专属性好、检测限低、回收率高，满足国内外对禽蛋中饲料着色剂最大残留限量要求。