蜡样芽胞杆菌是一种产芽胞的革兰阳性杆菌，广泛存在于环境和肉制品、汤、蔬菜及奶制品、米饭和面食等多种食品中，可引起腹泻型和呕吐型两种不同临床类型的食源性疾病^［1-2］。腹泻型食源性疾病的食物来源包括肉制品、汤、蔬菜及奶制品等，呕吐型食源性疾病的主要食物是米饭和面食^［3］。
        蜡样芽胞杆菌因其芽胞耐热在食品加工热处理后部分残留，食物保存不当可促使残留的芽胞萌发并大量繁殖产生多种毒素导致食源性疾病。蜡样芽胞杆菌引起食源性疾病的主要致病物质是其产生的两种肠毒素：致呕吐型肠毒素和致腹泻型肠毒素，与呕吐相关的毒力基因为呕吐毒素（ces）基因，与腹泻相关的毒力基因主要为溶血致死性肠毒素BL（Hbl）hblA、hblC和hblD以及非溶血性肠毒素（Nhe）NheA、NheB、NheC、细胞毒素K（CytK）、肠毒素T（bceT）和肠毒素FM（entFM）基因。蜡样芽胞杆菌引起的食物中毒多有报道^［3］，控制传染源是控制和降低此类细菌性食物中毒的重要措施。多位点序列分型（MLST）技术是基于微生物核苷酸序列比对的一种基因分型方法，其原理是通过比较微生物个体7个或更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其遗传特征^［4］。对该菌进行MLST基因分型，是研究该菌的分布特征和进行溯源的重要手段。CARDAZZO等^［5］对食源性疾病中分离的蜡样芽胞杆菌进行了毒力基因携带率和基因分型的调查研究，表明菌株携带毒力基因与该菌致病性存在一定关联，MLST分型显示携带毒力基因的优势克隆为ST142、ST370、ST372、ST376。HOFFMASTER等^［6］从严重感染患者、胃肠道疾病患者以及相关食物中分离的优势克隆为ST26、ST78和ST94，其中ST26与4次呕吐为主的食源性疾病暴发事件相关；因此，本试验对温州地区分离的蜡样芽胞杆菌进行毒力基因携带情况以及分型特征的研究，掌握不同来源蜡样芽胞杆菌的分子流行病学特征为预防和控制蜡样芽胞杆菌引起的食源性疾病事件提供理论基础。
        2007—2014年温州地区不同来源分离的127株蜡样芽胞杆菌，其中分离自食源性致病菌监测有114株，分别来自米饭、米粉、米线、凉皮、盒饭14株，婴幼儿配方食品89株和其他食品11株，另有来自食物中毒8株、血液1株和环境4株。
        全自动微生物分析系统VITEK2-compact、BCL芽胞菌鉴定卡均购自法国梅里埃，Mastercyclerep gradient S梯度PCR仪（德国艾本德），FR-98生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）。胰酪胨大豆多粘菌素肉汤、甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）、硫酸锰营养琼脂等蜡样芽胞杆菌培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，Taq PCR Master Mix（2）、琼脂糖等试剂均购自上海生工生物工程有限公司。
        将菌株划线于MYP琼脂平板上，30 ℃培养24 h，挑取典型菌落用全自动微生物生化鉴定仪进行系统生化鉴定，补充动力试验、根状生长试验、蛋白质毒素结晶试验进行确证，同时进行生化分型试验^［7］，根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P试验反应、明胶液化试验，将蜡样芽胞杆菌分成15个不同生化型别。
        取适量的蜡样芽胞杆菌纯培养菌落于1 ml双蒸水中制成菌悬液，100 ℃金属浴20 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液作为PCR反应模板。
        PCR法检测蜡样芽胞杆菌hblA、hblC、hblD、NheA、NheB、NheC、CytK、bceT、ces、entFM等10种毒力基因^［8］，PCR引物委托上海生工生物工程有限公司合成。
        根据www.mlst.net网站^［9］的MLST方法扩增蜡样芽胞杆菌的7个管家基因glpF、gmk、ilvD、pta、pur、pycA和tpi，扩增产物测序后，与蜡样芽胞杆菌MLST标准数据（http://pubmlst.org/bcereus/）^［10］进行比对获得该菌株的序列型别（ST）。运用BioNumerics 7.5生物信息学软件对所得蜡样芽胞杆菌ST型别进行聚类分析。
        127株蜡样芽胞杆菌中携带NheA、NheB和NheC基因的分别占98.4%、97.6%和94.5%，其他毒力基因的携带率为7.9%～34.6%，其中ces基因携带率最低（7.9%），具体结果见表1。按照NheA、NheB、NheC、hblA、hblC、hblD、ces及其他毒力基因的分布差异，所有菌株可分为A～F共6群，其中最常见群为A群（47.2%）和B群（29.9%），F群有1株蜡样芽胞杆菌未携带毒力基因（表2）。
        127株菌株除10株不能分型外，其余分为5型，其中9型占63.8%，10型占22.0%（表3）。
        根据毒力基因、生化分型结果随机选取72株菌株（食品59株、食物中毒8株、血液1株、环境4株）进行MLST基因分型，共分为28个ST型，最常见的ST型为ST26（13株，18.1%），见表4。
        BioNumerics 7.5软件对不同来源菌的等位基因编码进行聚类分析显示，本地区28个ST型被分为4个序列群和13个单态群（图1）。其中序列群
        蜡样芽胞杆菌产生的肠毒素和活菌数量是引起食源性疾病的重要因素。活菌量越高产生肠毒素越多，致病性越强。目前国内外报道的蜡样芽胞杆菌研究包括细菌计数和鉴定［7,11-12］以及该菌的致病物质和分子分型特征^［13-14］，如CARDAZZO等^［5］对蜡样芽胞杆菌进行了毒力基因和基因分子分型的研究报道以及KIM等^［15］对产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌进行了基因多样性研究。本试验结果显示99.2%（126/127）的蜡样芽胞杆菌存在毒力基因，同时携带NheA、NheB、NheC基因的菌株占94.5%（120/127），高于秦丽云等^［14］报道的29.0%携带率和BATCHOUN等^［16］报道的51.9%携带率，接近LEE等^［17］100%的携带率，说明温州地区分离株存在引起腹泻型食源性疾病的风险，而携带ces基因菌株虽然只占7.9%，但由于呕吐型食源性疾病比腹泻型更严重，呕吐毒素摄入30 min后就可出现呕吐症状，因此更应关注携带呕吐毒素引起的食源性疾病事件。
        本试验研究的蜡样芽胞杆菌85%以上生化分型结果集中在9和10型，但部分菌株生化结果难判断，有少数菌株按照现有的国家标准无法进行分型^［7］，同时因生化分型操作方法复杂等因素，造成分型不够精确^［13］，难于满足实际工作需求。
        而MLST能够在鉴别病原的同时进行病原间遗传相关性分析，如果7个管家基因的位点有4个或者更多相同，则病原个体之间的遗传距离相近，属于相同的克隆复合体^［4］。本试验对72株菌株进行MLST分型鉴定，结果显示ST26、ST92、ST144和ST164为温州地区分离株中常见ST型，说明温州地
        区蜡样芽胞杆菌的遗传多样性。特别是序列群1包含3种ST型（ST26、ST144、ST164）占40.3%，为温州地区主要的ST型，分离自食品、食物中毒和环境，包括A、B、C毒力基因群，说明食品和环境样品中存在可能引起两种不同类型的食源性疾病的菌株，HOFFMASTER等^［6］认为ST26是最常见ST型，与呕吐型食源性疾病暴发事件密切相关，因此更应该关注ST26型携带毒力基因菌株引起的食源性疾病；而序列群3包含3种ST型（ST205、ST368、ST1 017）占8.3%，分离自食品和血液，包括A、B、D毒力基因群，应该同时做好蜡样芽胞杆菌引起临床感染的监测工作；13个单态群中最常见的为ST138和ST156，而来自食物中毒的3株菌株构成两个单态群ST145和ST177，说明这些ST型引起的食源性疾病事件更应该加强关注。
        本试验表明温州地区蜡样芽胞杆菌毒力基因携带率较高，同时遗传关系具有多样性，说明应该深入开展对食品和食源性疾病中分离到的蜡样芽胞杆菌毒力基因携带情况以及基因分型特征等的研究。