粪肠球菌是我国农业部批准的可用于饲料添加的菌种之一，其在畜禽养殖和肉制品生产加工的各个环节中都有分布，是评估食品、食品加工设备及食品生产环境卫生状况的指标菌之一。耐药肠球菌已经成为院内感染的重要病原菌。2014年我国主要地区临床分离革兰阳性菌中，肠球菌属菌株占第二位，其中粪肠球菌的比例为45.4%^［1］。食源性途径是耐药菌株（包括其耐药基因）由动物到人的主要传播途径。动物肠道致病菌和耐药菌如沙门菌、空肠弯曲菌等在屠宰和食品加工过程中极易污染肉及其制品，人在摄食这些食物后除了会造成食源性传染病的暴发外，细菌的耐药性也会造成临床治疗的困难和耐药基因的传播^［2-5］。然而现在对于食品中粪肠球菌的耐药性、致病基因、基因分型等特征的了解较少，因此开展肉及其制品分离粪肠球菌耐药及毒力基因携带特征调查，对于了解地区范围内肉及其制品中粪肠球菌对人类健康的潜在威胁具有重要意义。多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）是一种基于管家基因序列比对的分子分型方法，由于其操作简单，结果客观可靠，且易于实验室间比较的特点而广泛用于多种病原菌的流行病学研究。通过公共数据库，MLST可以实现某些病原菌在全球范围的长期数据比较分析^［6］。在欧洲的一项对多个国家医院和社区分离的粪肠球菌研究^［7］表明，多重耐药粪肠球菌多属于CC2，CC16和CC87三个克隆群。其中CC16（ST16为主要代表）克隆群的多重耐药粪肠球菌在医院和社区都有分布，且社区中对高浓度氨基糖苷类抗生素耐药的粪肠球菌绝大多数都为ST16型。多个致病基因参与粪肠球菌的致病过程，其感染机制较为复杂，目前研究较透彻的致病基因为细胞溶血素（cytolysin，cylA）、明胶酶E（gelatinase，gelE）、表面蛋白（enterococcal surface protein，esp）和聚集物质（aggregation substance，asa1）这4种^［8-11］。研究粪肠球菌携带毒力基因的情况，并对其进行分子分型可以有效筛查出具有潜在致病性的粪肠球菌。本研究对四川省自贡市多个菜市场、农贸市场和餐馆贩卖肉及其制品携带的粪肠球菌进行研究，了解其耐药及携带毒力基因的情况，并对多重耐药粪肠球菌进行MLST分析，以了解该地区肉及其制品中携带具有潜在致病性粪肠球菌的情况，评估其对人类健康的潜在威胁。

        2013年4月17～21日在四川省自贡市的6个菜市场、农贸市场和餐馆采集肉及其制品样品147份。样品包括生肉（生牛肉）、腊肉、熟肉制品和酱卤肉制品。药敏试验质控菌株粪肠球菌（ATCC 29212）为本实验室保藏。毒力基因检测阳性对照菌株屎肠球菌（ATCC BAA-472）和粪肠球菌（ATCC 51299）均购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。
        MicroScan WalkAway 40 SI全自动微生物鉴定仪（美国贝克曼库尔特）、SensoQuest Labcycler PCR仪（德国Senso）、Gel Doc XR+System凝胶成像系统（美国Bio-Rad）、BAGMIXER均质器。Ex Taq^TM Version 2.0 plus dye（大连宝生物工程有限公司）；BacteriaGen DNA细菌基因组提取试剂盒（北京康为世纪公司）；Pos MIC Panel Type 29革兰阳性菌药敏板（美国贝克曼库尔特）；哥伦比亚血平板（英国Oxoid）；KF链球菌选择性培养基（北京陆桥技术有限公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，PCR产物纯化及测序由北京天一辉远生物科技有限公司完成。
        在无菌条件下取25 g肉及肉制品放入装有225 ml缓冲蛋白胨水的均质袋中，以8 000 r/min均质1～2 min，制成1∶10的样品匀液。
        将处理后的样品接种于KF链球菌选择性培养基，37 ℃、5%CO2条件下培养48 h。挑选3～5个可疑单菌落（紫色、圆润、大菌落）接种于哥伦比亚血平板上进行纯化培养。采用API 20 Strep生化鉴定系统对纯培养物进行生化鉴定；同时使用DNA试剂盒按照说明书提取纯培养物的基因组核酸，进行16S rDNA序列和sodA基因序列^［12］鉴定。每份阳性样品仅保留1株粪肠球菌。
        使用MicroScan WalkAway 40 SI全自动微生物鉴定仪及其配套的Pos MIC Panel Type 29革兰阳性菌药敏板，按照仪器和药敏板使用说明，使用快速接种法进行药敏试验。药敏结果判断参照2015年美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准^［13］。
        使用聚合酶链式反应（PCR）方法对粪肠球菌分离株的4种毒力基因：cylA、gelE、esp、asa1进行检测。引物序列及产物长度见表1。PCR反应体系为：2×Ex Taq Mix 10 μl，10 μmol/L的上下游引物各1 μl，模板DNA 1.0 μl，加水至20 μl。
PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。阳性对照基因为屎肠球菌（ATCC BAA-472，asa1、gelE基因阳性）和粪肠球菌（ATCC 51299，esp基因阳性）。
对cylA基因扩增阳性产物进行序列测定和比对以确认结果。         粪肠球菌的MLST试验方案参考粪肠球菌MLST数据库（http://pubmlst.org/efaecalis/）提供的分型方案，7个管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yqiL的引物序列及产物大小见表1。PCR反应体系为：2×Ex Taq Mix 25 μl，10 μmol/L的上下游引物各2.5 μl，模板DNA 2.0 μl，加无菌水至50 μl。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经纯化后，进行双向测序。序列分析用SeqMan软件对等位基因序列进行拼接和校正，将整理好的序列提交至MLST数据库，确定每个管家基因的序列号，7个管家基因序列号的组合即为该菌株的ST型。应用eBURST软件构建eBURST图以确定分离菌株与数据库其他菌株的关系，以两个等位基因的差异为定义克隆群的标准。
        147份肉及其制品样品中共有65份样品分离出粪肠球菌（65株），阳性率为44.2%（65/147）。65株粪肠球菌对13种常见抗生素表现出不同程度的耐药情况，详细结果见表2。其中耐药粪肠球菌为38株，耐药率为58.5%（38/65）。在38株耐药粪肠球菌菌株中，仅对1种抗生素耐药的菌株有18株，对2种抗生素耐药的菌株有6株，多重耐药菌株有14株。不耐药的菌株共27株，其中3株菌株对13种抗生素全部敏感，对1～2种抗生素中介的菌株有24株。65株分离的粪肠球菌对四环素的耐药率最高，达到了41.5%（27/65）；对利福平和氯霉素的耐药率次之，分别为29.2%（19/65）和20.0%（13/65）；
        对65株粪肠球菌进行4种常见毒力基因（cylA、gelE、esp和asa1）携带情况检测，结果表明4种毒力基因在65株分离株中均有携带，其中gelE基因阳性率最高，为56.9%（37/65），asa1、esp和cylA基因的阳性率分别为21.5%（14/65）、9.2%（6/65）和7.7%（5/65）。耐药粪肠球菌gelE基因阳性率为73.7%（28/38），而不耐药的菌株阳性率为33.3%（9/27）。asa1基因在粪肠球菌中的携带情况与gelE基因相似，其在耐药菌株中的阳性率为28.9%（11/38），而在不耐药菌株中的阳性率为11.1%（3/27）。除1株不耐药菌株携带esp基因外，其他esp基因阳性菌株均为多重耐药粪肠球菌，cylA基因的携带情况与esp基因一致。
        14株多重耐药菌株共有9个MLST型别，分别为ST16（4株）、ST81（2株）、ST480（2株）以及ST93、ST102、ST116、ST412、ST472和ST634各1株，各个ST型别在MLST数据库中的位置见图1。相同ST型别的粪肠球菌有相似的耐药谱和毒力基因携带情况。在4株ST16粪肠球菌中除1株为利福平中介，且esp基因阴性的菌种外，其他3株的耐药谱和毒力基因携带情况一致，耐药谱为高浓度庆大霉素-四环素-氯霉素-红霉素-利福平，esp-asa1-cylA阳性。而ST81和ST480耐药谱和毒力基因携带情况也存在一致性，表现为2株ST81菌株耐药谱为四环素-氯霉素-利福平，红霉素中介和gelE基因阳性；2株ST480菌株则是对本试验中的13种抗生素都耐药，同时esp基因呈阳性。具体情况见表3。注：箭头标记的为本研究中分离菌株的ST型别
        随着现代养殖业的发展，抗生素的使用量和使用范围不断扩大，抗生素不仅用于治疗感染性疾病，还被用于饲料添加剂以加快畜禽生长速度和提高饲料转化效率。据统计，2013年我国消耗抗生素16.2万吨，其中52%为兽用^［14］。喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类以及利福平等抗生素广泛用于畜牧业和水产养殖业，这些抗生素的大量使用造成动物中耐药菌的大量出现和耐药基因的广泛传播。在屠宰及食品加工过程中，这些耐药菌可能会污染肉及其制品，最终导致食品中携带对