黄曲霉毒素B1（AFB1）是迄今已知最强的化学致癌物之一^［1］，可同时诱发多种癌症，此外还具有强烈的致畸性和致突变性^［2］。玉米赤霉烯酮（ZEN）会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤，还可诱导DNA收缩，导致染色体失常^［3］。呕吐毒素（DON）严重影响人的消化系统，具有细胞毒性、免疫毒性和神经毒性^［4］。这3种毒素普遍存在于谷物中，超过国家限量标准后，对人类的健康和安全造成严重威胁，在GB 2761—2011《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》^［5］中规定，AFB1在麦仁和小米中的限量值为5 μg/kg、玉米糁中限量值为20 μg/kg、大米中限量值为10 μg/kg；ZEN在谷物及其制品中的限量值均为60 μg/kg；DON在谷物及其制品中的限量值均为1 000 μg/kg，玉米、玉米糁（渣、片）、大麦、小麦、麦片、小麦粉的限量值均为1 000 μg/kg；因此，对谷物中真菌毒素的检测是一项艰巨而重要的任务。
        目前，检测AFB1、ZEN和DON的方法有很多，主要有薄层色谱（TLC）法、气相色谱（GC）法、高效液相色谱（HPLC）法、酶联免疫吸附（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法^［6-10］。TLC是应用最早、最广泛的检测技术，也是检测真菌毒素最经典的方法。但其灵敏度低、重现性差、操作繁琐、时间长且安全性差。GC和HPLC可以对样品中真菌毒素进行精确定量，而且结果稳定，是最权威的方法，但前处理相对复杂，检测周期长，需要昂贵的仪器并耗费大量人力。ELISA操作相对简单、灵敏度高，但也需要专门仪器，耗时较长。此外，以上检测技术均为单一指标检测，不能同时检测多种真菌毒素。针对上述检测技术的不足，本试验应用胶体金免疫层析法研制AFB1、ZEN和DON检测试纸条并组装成三联检测卡，检测谷物中污染的真菌毒素。该法操作简单、快速，不需要专业人员和仪器设备，适合现场检测，值得推广应用。
        北京市某超市、某集贸市场购买的小米、玉米糁、麦仁和大米，各15份。
        HM3030型XYZ三维划膜喷金仪（上海金标）、紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、真空干燥箱、低温高速离心机、ZQ3500型数控快速斩切机、恒温培养箱、切条机、磁力搅拌器、pH计。
        AFB₁单克隆抗体、ZEN单克隆抗体、DON单克隆抗体、AFB1-牛血清白蛋白（BSA）、ZEN-BSA、DON-BSA、山羊抗小鼠IgG均购自洛阳佰奥通生物技术有限公司，AFB1［GBW(E)100302］、ZEN［GBW(E)100301］、DON［GBW(E)100383］标准品均购自国家标准物质中心，硝酸纤维素膜（NC膜，德国赛多利斯），聚氯乙烯（PVC）底板、样品垫、吸水纸、玻璃纤维均购自上海金标生物公司，氯金酸（美国Sigma），碳酸钾，柠檬酸三钠，阴性样品：仪器方法确定的不含AFB1、ZEN和DON的小米、玉米糁、麦仁和大米。
        用超纯水将1.0%氯金酸稀释成0.01%，置于磁力搅拌器上搅拌煮沸，迅速加入1.0 ml 1%柠檬酸三钠，继续加热煮沸15 min，溶液由灰色变成黑色，随后稳定成红色。关闭加热电源，冷却至室温后用超纯水补足体积，用紫外可见分光光度计扫描来估算金颗粒的大小，4 ℃条件下保存备用。
        取10支5 ml玻璃小试管，分别加入1.0 ml胶体金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3调节pH值为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，每管加入10 μg AFB1单克隆抗体。混匀并静置10 min后，分别加入100 μl 10%NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察溶液颜色的变化。溶液保持红色的最低pH值可确定为胶体金溶液的最适pH值。胶体金结合ZEN和DON单克隆抗体的最适pH值也按此方法确定。
        3种抗体分别选择1.2.2中确定的最适pH值的胶体金溶液，各取9管，每管1.0 ml。加入不同量的抗体，AFB1单克隆抗体加入量的范围为20～55 μl（抗体浓度0.1 mg/ml），ZEN和DON单克隆抗体加入量的范围均为2.0～16 μl（抗体浓度1.0 mg/ml），补足体积至1.1 ml，对照管仅加0.1 ml稀释液，混匀。5 min后，在各管加入0.1 ml 10% NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察溶液颜色的变化。溶液保持红色的最低抗体量可确定为稳定胶体金的最低抗体量。在最低抗体量的基础上再增加10%～20%即为胶体金标记的最佳抗体量^［11］。
        将1.0 mg/ml的山羊抗小鼠IgG包被在NC膜的质控线（C线）上，同时将AFB1-BSA、ZEN-BSA和DON-BSA分别梯度稀释成0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mg/ml 7个浓度包被在NC膜的检测线（T线）上，喷量均为1.0 μl/cm，间距为5 mm，37 ℃干燥2 h，作为试纸条的检测区，与最适条件下制备的结合垫组装成试纸条。
AFB1检测浓度为0、0.5、1.0和2.0 ng/ml的标准品，ZEN检测浓度为0、5.0、10和20 ng/ml的标准品，DON检测浓度为0、100、200和300 ng/ml 的标准品，比较AFB1-BSA/ZEN-BSA/DON-BSA浓度的变化对试纸条检测结果的影响。选择检测线最佳浓度的标准如下：阴性溶液［0.01 mol pH=7.4 磷酸盐（PBS）缓冲液］滴定时，C线和T线显色深度适中，两线显色一致或T线显色大于C线；用标准品滴定时，试纸条灵敏度越高越好。
        将胶体金标记的单克隆抗体（以下简称金标抗体）喷在玻璃纤维上制成结合垫，将完全抗原和山羊抗小鼠IgG包被于NC膜上，分别作为T线和C线。经处理的样品垫（1.5 cm×10 cm）、结合垫（1.5 cm×10 cm）、NC膜（2.5 cm×10 cm）和吸水垫（1.5 cm×10 cm）每两部分以2 mm重叠，依次粘在PVC底板（6 cm×5 cm）上，用切条机切成宽3 mm的胶体金免疫层析试纸条，其侧面结构示意图见图1。将3种试纸条按指定位置放入三联检测卡卡槽内，盖上卡盖，组装成三联检测卡（见图2）。
        将玉米糁粉碎后过0.850 mm筛孔的筛子。称取2.0 g样品置于50 ml的离心管中，加入4.0 ml的甲醇-PBS缓冲液（7∶3，V/V），充分振荡5 min，5 000 r/min离心6 min。取上清液0.2 ml加入0.8 ml PBS缓冲液稀释5倍作为待测液。
用滴管吸取待测液滴加于加样孔中，每孔2～3滴。加样后开始计时，结果应在5～8 min读取，其他时间判读无效。读取结果时，检测卡中每个试纸条结果解释见图3。
        不同种类样品中3种毒素检测限的确定：4种阴性样品（小米、玉米糁、麦仁和大米）分别取15份，每份2.0 g。分别加入不同浓度的AFB1、ZEN和DON标准品，AFB1加入标准品的浓度分别为0、2.5、5.0、10和20 ng/g，ZEN加入标准品的浓度0、15、30、60和90 ng/g，DON加入标准品的浓度为0、500、750、1 000和1 500 ng/g，每个浓度做3次重复。按照1.2.6方法检测样品中毒素含量。
        与HPLC法比较：按照1.2.6方法检测样品中3种毒素含量，大于等于检测限的判为阳性，反之判为阴性。同时用HPLC法分别检测样品中的ZEN^［12］、DON^［13］和AFB1^［14］，根据国家规定的真菌毒素在谷物中的限量标准判定结果^［5］。
        特异性试验：通过与结构类似物及其他霉菌毒素的交叉反应试验来研究。用含15%甲醇的PBS缓冲液分别将AFB1、AFM1、AFB2、DON、赭曲霉毒素A、T-2毒素、ZEN、玉米赤霉醇制备成浓度为1.0、5.0、100和500 ng/ml的溶液，用三联检测卡进行检测。
        稳定性试验：将三联检测卡置于铝箔袋中，加干燥剂密闭包装，放于37 ℃条件下保存8周。分别在第1天、第2天、第4天、第7天以及之后的每周取出三联检测卡检测含15%甲醇的PBS缓冲液及浓度为100 ng/ml的3种标准品溶液。观察T线、C线的显色强度、稳定性情况及金标抗体的释放情况。         胶体金溶液为澄清的酒红色，未发现漂浮物及颗粒沉淀物，用紫外可见分光光度计扫描可知（见 图4），紫外扫描的最大吸收峰波长为525 nm。根据回归方程y=0.4271x+514.56计算^［15］，得到胶体金颗粒直径大小为25 nm。
        不同pH值的胶体金溶液与抗体结合，若pH值未达到同蛋白结合的最适点时，胶体金会聚沉，溶液由红色变为蓝色，保持红色的最低pH值作为最适pH值。由此可知，AFB1金标抗体、ZEN金标抗体的最适pH值均为7.5， DON金标抗体的最适pH值为7.0。
        取一系列pH值为7.5（AFB1和ZEN抗体最适）和7.0（DON抗体最适）的胶体金溶液，确定了3种抗体最适标记量，结果见表1。可以看出，向1 ml胶体金溶液中加入AFB1抗体量≥3.5 μg，或加入ZEN抗体量≥6 μg，或加入DON抗体量≥8 μg，溶液稳定，颜色由蓝色变为稳定的红色。在此基础上，增加20%的蛋白量即为最适抗体用量^［11］。因此，AFB1、ZEN和DON抗体的最适浓度分别为4.2、7.2和9.6 μg/ml。
        C线山羊抗小鼠IgG包被浓度为1.0 mg/ml，当T线AFB1-BSA包被量为1.0 mg/ml，AFB1试纸条显色较好，加标后有明显的梯度，标准品浓度≥1.0 ng/ml时，试纸条检测为阳性；当T线ZEN-BSA包被量为1.4 mg/ml，加标后有明显的梯度，标准品浓度≥5.0 ng/ml时，试纸条检测为阳性；当T线DON-BSA包被量为0.8 mg/ml，加标后有明显的梯度，标准品浓度≥100 ng/ml时，试纸条检测为阳性。由此可见AFB1、ZEN和DON试纸条的灵敏度依次为1.0、5.0、100 ng/ml。
        如表2所示，阴性样品小米和麦仁中，AFB1加入浓度为2.5 ng/g时，结果显示阴性，而加入5.0 ng/g 及以上浓度时，结果为阳性，说明样品检测限为5.0 ng/g。同理，阴性样品玉米糁和大米中AFB1的检测限均为10 ng/g，说明不同样品中AFB1的检测限不完全相同。而在小米、玉米糁、麦仁和大米4种样品中，ZEN的检测限均为60 ng/g，DON的检测限均为1 000 ng/g。所有检测项目重复3次试验，结果均一致，试验重复性较好。         检测样品中AFB1、ZEN和DON时，两种方法结果均一致，阳性率分别为33.3%（20/60）、38.3%（23/60）和33.3%（20/60）。4种样品中，玉米糁受3种毒素污染的情况最为严重，阳性样品数分别为7份（AFB1）、9份（ZEN）和7份（DON），阳性率依次为46.7%（7/15）、60.0%（9/15）和46.7%（7/15），小米受污染情况最轻，阳性样品数分别为4份（AFB1）、3份（ZEN）和2份（DON），阳性率分别为26.7%（4/15）、20.0%（3/15）和13.3%（2/15）。结果见表3。
        3种试纸条检测各自浓度小于灵敏度的标准品时，结果为阴性，检测浓度大于等于灵敏度的标准品时，结果为阳性；但检测浓度为1.0、5.0、100和500 ng/ml的结构类似物及其他霉菌毒素时，结果均为阴性，表明试纸条的特异性较好，并且3种真菌毒素之间没有交叉反应。结果见表4。
        检测卡于37 ℃条件下保存8周，检测阴性溶液均为两条线（T线和C线），检测100 ng/ml的标准品均为一条线（C线），且T线和C线条带清晰。因此根据37 ℃条件下1 d相当于室温下1周计算^［16］，本检测卡在室温可以保存12个月。
        为了能够准确、快速、简便的检测谷物（小米、玉米糁、麦仁和大米）中AFB1、ZEN和DON，本试验应用GICA法研制出3种试纸条并组装成真菌毒素三联检测卡。该卡在检测样品时，选择能较好溶解AFB1、ZEN和DON的甲醇-PBS缓冲液（7∶3，V/V）