喹诺酮类（quinolones，QNs）药物是一类人工合成的抗菌药，具有抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强、价格低廉等优点^［1］，广泛用于禽兽及水产养殖疾病的治疗和预防。过量使用会导致药物在动物体内蓄积，现已报道动物源性食品中已有检出^［2-3］，对人类的健康构成了危害，残留问题已引起人们的广泛关注。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会、欧盟已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量^［4］，美国食品和药物管理局规定了家禽肉中的部分喹诺酮类药物限量，我国农业部公告第235号^［5］对达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、恶喹酸、沙拉沙星制定了最高残留限量。
        检测喹诺酮类残留的常见方法有高效液相色谱（HPLC）法^［6-7］、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法^［8-11］。HPLC-MS/MS具有选择性强、灵敏度高等特点，成为喹诺酮类残留分析的首选方法，当前现行检测喹诺酮类残留的国家标准方法为液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法^［12-14］。但多数方法采用外标法定量，内标法定量报道比较少^［15-18］。外标法定量存在很强的基质干扰问题。本试验在前人研究的基础上，建立了超高压液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法同时检测禽类食品中11种喹诺酮类药物残留的方法，该方法采用同位素内标法定量，且每个化合物均有对应的同位素内标，解决了几个化合物共用同一同位素内标带来的校正偏差的问题，有效校正了基质效应所引起的定量误差，降低了样品在提取、净化等过程中待测物的损失，大大提高了分析效率，保证了检测结果的准确性，适合大批量样品中喹诺酮类药物残留的快速测定。
        ACQUITY^TM UPLC超高压液相色谱仪、ZEVO TQ MS串联质谱仪、8010G样品均质杯均购自美国Waters，Milli-Q超纯水系统，漩涡混匀器。
        11种喹诺酮类标准物质：氧氟沙星（CAS：82419-36-1）、培氟沙星（CAS：70458-92-3）、诺氟沙星（CAS：70458-96-7）、环丙沙星（CAS：85721-33-1）、洛美沙星（CAS：98079-51-7）、达氟沙星（CAS：119478-55-6）、双氟沙星（CAS：91296-86-5）、恩诺沙星（CAS：93106-60-6）、氟甲喹（CAS：42835-25-6）、恶喹酸（CAS：14698-29-4）、沙拉沙星（CAS：98105-99-8）均购自德国Dr.Ehrenstorfer；11种同位素内标准物质：氧氟沙星-D3（CAS：1173147-91-5）、培氟沙星-D5（CAS：1228182-51-1）、诺氟沙星-D5（CAS：1015856-57-1）、环丙沙星-D8（CAS：1130050-35-9）、洛美沙星-D5（CH021-25）、达氟沙星-D3（CAS：1217683-55-0）、双氟沙星-D3（CAS：1173021-89-0）、恶喹酸-D5（CAS：1189890-98-9）均购自百灵威科技，恩诺沙星-D5（CAS：1173021-92-5）、沙拉沙星-D8（CAS：1352879-52-7）均购自德国Dr. Ehrenstorfer，氟甲喹-¹³C3（CAS：1185049-09-5，美国TRC）；甲醇、甲酸、乙腈、氨水、乙酸铵均为色谱纯。
        标准储备液：分别称取适量的标准物质及同位素内标物质，用甲醇溶解，并定容至刻度，配制成100 μg/ml的标准储备液，避光保存于-20 ℃冰箱。
        混合标准工作液：分别准确移取上述标准储备液10 μl移至10 ml容量瓶中，用5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）稀释至刻度，混匀，配制成100 ng/ml的混合标准工作液；分别准确移取上述同位素内标标准储备液10 μl移至10 ml容量瓶中，用5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）稀释至刻度，混匀，配制成100 ng/ml 的混合内标工作液，现配现用。
        标准系列应用液：分别准确移取上述混合标准工作溶液（100 ng/ml）5、10、50、100、200、500、1 000、5 000 μl移至10 ml容量瓶中，加入500 μl混合内标工作液，用5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸）定容至刻度，配制成0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/L的标准系列应用液。
        鸡肉样品经高速组织捣碎机均匀绞碎，用四分法缩分出适量样品，均分成两份，转入清洁容器内，加封后作出标记，一份用于分析，另一份用于留样，于-20 ℃条件下保存。鸡蛋样品去壳混合均匀，转入清洁容器内，加封后作出标记，一份用于分析，另一份用于留样，于-20 ℃条件下保存。
        准确称取2.0 g（精确到0.01 g）均质样品置于50 ml具塞离心管中，加入50 μl同位素混合内标工作液，涡旋混匀，再加入10 ml 1%乙酸乙腈（1∶100，V/V），涡旋1 min，超声波提取10 min，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min，取上清液于另一个离心管中。残留物再重复提取一次，合并两次提取液，加入5.0 g无水硫酸钠，4 ℃ 10 000 r/min离心5 min 后取上清液于40 ℃下氮气吹干。准确加入1.0 ml 5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），涡旋振荡溶解残留物，冷冻离心后（4 ℃ 10 000 r/min离心5 min），取上层液，再加入2.0 ml正己烷，涡旋混合30 s，转移至15 ml具塞离心管中，5 000 r/min离心5 min，弃去上层，下层液体经0.45 μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS测定。
        UPLC：色谱柱为Waters Acquity^TM UPLC BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温40 ℃，样品室温度10 ℃，进样体积10 μl，流动相A为10 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）、流动相B为甲醇，流速0.3 ml/min，梯度洗脱条件见表1。
        质谱：离子源为电喷雾离子源（ESI），电离模式为ESI+，检测方式为多反应监测（MRM），毛细管电压3.8 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度
        分别称取已绞碎均匀的阴性样品2.0 g（精确到0.01g）于3个50 ml离心管中，分别按1.0、5.0和10.0 μg/kg浓度添加11种喹诺酮混合标准工作液，提取步骤同1.2.2样品前处理。         本试验比较了0.1%甲酸水-乙腈、5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇乙腈溶液（40∶60，V/V）、5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-甲醇、10 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-甲醇等6个流动相体系对分离的影响。据文献^［8］报道，流动相的pH值对喹诺酮类药物的分离和保留具有明显影响，使用纯水为流动相时，11种喹诺酮类药物不能完全分离，其中氟甲喹和恶喹酸几乎是同一时间出峰，加入少量的甲酸控制流动相的pH值，不仅能提高待测物分离度，还能提供质子，提高正离子的灵敏度，试验比较了不同浓度甲酸对灵敏度的影响，甲酸含量为0.1%时，11种喹诺酮类药物的峰强度最大，增加甲酸含量，峰强度几乎不变，故选用0.1%甲酸水。水相中加入电解质乙酸铵，在保持较好分离度的前提下改善了离子峰的峰形，可以获得对称性好的色谱峰；另外，正离子模式下，与乙腈相比，甲醇能提供质子，增加离子强度，提高灵敏度；因此采用10 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）-甲醇作为流动相，使用表1的梯度洗脱，实现了11种喹诺酮的完全分离，且各峰形尖锐、对称性好（见图1）。
        GB/T 20366—2006《动物源产品中喹诺酮类残留量的测定 液相色谱-串联质谱》^［12］采用2%甲酸乙腈提取，乙腈饱和，正己烷脱脂，过微孔滤膜进样；GB/T 21312—2007《动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》^［13］采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine（EDTA为乙二胺四乙酸二钠，Mcllvaine为0.1 mol/L柠檬酸溶液与0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液的混合缓冲液）缓冲溶液提取，HLB柱净化。本试验在溶液、乙腈与0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲液4种提取溶剂的提取效果。结果显示，采用0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取样品时，提取液浑浊且黏稠，杂质多，易堵塞HLB柱，向缓冲溶液中加入乙腈，沉淀蛋白，提取液变澄清，随乙腈含量的增加，沉淀蛋白效果明显，但使用HLB柱净化时，提取液需要稀释以降低乙腈含量，过程繁琐。另外，喹诺酮类药物是两性化合物，在纯乙腈中加入乙酸有利于待测物溶解在提取液中，提高回收率，本试验优化了乙酸的含量，发现使用1%的乙酸时，待测物的加标回收率最高；因此，采用1%乙酸乙腈（1∶100，V/V）进行提取。         动物源性食品中脂肪含量高，往往会影响回收率和测定结果的稳定性，用乙腈提取时，许多干扰物也会被提取出来，油脂是主要干扰物，为了去除基质中的脂肪类干扰物，采用高速冷冻离心除脂法，在低温状态下脂肪粒以固体状态从溶液中析出，以达到净化分离效果。复溶后，加入正己烷液液分配除去不饱和脂肪酸类油脂杂质，冷冻离心与正己烷脱脂两个净化步骤相结合，能有效地去除样品中的油脂类干扰物。
        在应用UPLC-MS/MS测定基质复杂样品时，基质通常对分析物的离子化具有增强或抑制效应，可能严重影响定量的准确性^［19］。本试验考察了基质效应对喹诺酮类药物的影响，以阴性样品提取液作为溶剂，配制5.0 ng/ml的混合标准工作液，测定其峰面积为A；以初始流动相为溶剂，配制5.0 ng/ml的混合标准工作液测定其峰面积为B。基质效应ME（%）=B/A×100%^［20］，其中ME>100%为基质增强效应，ME<100%为基质抑制效应^［21］。表3可以看出，样品提取液对目标化合物存在一定的基质影响。本方法选取11种待测物同位素内标校正，按照1.2.2样品前处理的方法进行处理，制定标准曲线，由于样品溶液有已知浓度的内标，从而减少了样品基质效应的影响，确保方法的灵敏度、重现性和定量分析准确性。
        选取阴性空白样品，加入标准系列应用液，按照1.2.2样品前处理的步骤进行处理，上机测定，以待测物峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，μg/L）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程（见表3），各待测物的浓度在0.05～50.0 μg/L的范围内与其峰面积呈良好的线性关系，相关系数R²均≥0.997 4。
        添加0.05 μg/kg浓度时，各待测物峰的信噪比（S/N）均大于3，故将其定为检出限；定量限定义为在获得理想的回收率和标准偏差条件下，可以检测到的样品溶液中目标化合物的最低浓度^［9］，本方法的定量限为0.5 μg/kg，该浓度下的添加回收率与相对标准偏差（RSD）均能够满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》^［22］的相关要求。
        我国农业部2002年235号公告^［5］中限量标准最严的是沙拉沙星，其限值为10.0 μg/kg。按此限量标准进行加标试验，考察该方法是否满足各化合物标准限值，称取2.0 g（精确到0.01 g）阴性样品，添加混合标准工作液，使加标水平分别达到1.0、5.0和10.0 μg/kg，加入混合内标工作液，按照1.2.2样品前处理方法进行处理，上机测定，每个添加水平进行3次平行测定。结果如表4所示，回收率范围为82.4%～104.3%，RSD范围为1.0%～14.6%。
        应用本方法分别测定鸡肉与鸡蛋样品，结果发现，样品中检出恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星和诺氟沙星，其余各组分均未检出，实际检出率低于10%［鸡肉为6.8%（6/88），鸡蛋为8.8%（7/80）］，含量为1.75～42.9 μg/kg，均未超出农业部2002年235号公告^［5］中限量标准。
        本试验建立了禽类食品中11种喹诺酮类残留检测的UPLC-MS/MS分析方法。通过对UPLC条件和样品前处理条件的优化，采用1%乙酸乙腈（1∶100，V/V）提取样品，冷冻离心与正己烷脱脂两步净化和同位素内标法补偿基质效应，使得方法的灵敏度、准确度和精密度均能满足兽药残留分析要求。本方法样品前处理简单，回收率高，适合批量样品的快速测定。