弯曲菌（Campylobacter）最早发现于1963年，空肠弯曲菌是全球引起胃肠道感染的主要病原菌之一，并与格林-巴利综合症（GBS）及米尔-费歇综合症（MFS）等神经系统疾病的发生有密切关系^［1］。据国外文献^［2］报道，使人致病的弯曲菌中99%为空肠弯曲菌，其次是结肠弯曲菌。在美国和英国等发达国家，弯曲菌引起的肠炎病例位居首位^［3］。弯曲菌为食源性致病菌，主要通过未煮熟的禽肉和生畜肉使人发病^［4］，尤其是空肠弯曲菌的某些血清型引起的格林-巴利综合症，对人类健康造成了严重威胁。随着抗生素在动物养殖过程中的广泛应用，耐药元件可通过质粒、转座子、整合子等方式实现细菌之间的水平转移，从而使大量多重耐药细菌在动物、人、食品中传播，直接导致临床治疗负担加重。
        本研究通过对屠宰前肉鸡和市售鸡肉弯曲菌携带率的调查及分离菌株药敏试验结果分析，了解石家庄市肉鸡屠宰和市售环节弯曲菌的污染和耐药情况，为禽类食品安全风险评估、弯曲菌所致疾病的防控和临床用药提供技术资料。
        随机采集石家庄市2个屠宰厂屠宰前肉鸡肛拭子和预冷后分割前的鸡酮体涂抹拭子标本，石家庄市内五区农贸市场和超市销售鸡肉、鸡肝脏等样品，采集时间为2013年7、8、9和11月。
        PTC-200型PCR扩增仪（美国M.J.Research PCR）、xcel型全自动毛细管电泳仪（德国Qiagen）、CB150型三气培养箱、离心机。
        Bolton肉汤、mCCDA培养基、裂解马血、Carry-Blari运送培养基均购自英国OXOID，脱氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L）、DNA聚合酶（2.5 U/μl）、5×Prime STAR^TM Buffer均购自日本Takara，100～3 000 bp DNA Size Marker（德国Qiagen），引物由大连宝生物公司合成（详见表1），药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司，分别为萘啶酸（NA，30 μg）、左氧氟沙星（LVF，5 μg）、环丙沙星（CIP，5 μg）、庆大霉素（GM，10 μg）、链霉素（S，10 μg）、丁胺卡那（AN，30 μg）、阿奇霉素（AZI，15 μg）、红霉素（E，15 μg）、多西环素（DOX，30 μg）、四环素（TC，30 μg）、克林霉素（CM，2 μg）、氟苯尼考（FFC，30 μg），所有试剂均在有效期内使用。
        肉鸡肛拭子：用无菌生理盐水润湿的无菌棉拭子轻轻旋入鸡肛门内约3～4 cm处，旋转刮取肠粘膜后退出，将拭子插入含有5 ml Bolton肉汤的试管内，弃去手接触的拭子部位，将肛拭子放入带有微需氧产气袋的密封盒子中，2 h内送实验室检测。
        鸡酮体涂抹拭子：用无菌生理盐水润湿的无菌棉拭子在预冷后分割前鸡酮体脖颈和翅膀等皱褶多的皮肤表面进行多点涂抹，将拭子插入含有5 ml Bolton肉汤的试管内，弃去手接触的拭子部位，将拭子放入带有微需氧产气袋的密封盒子中，2 h内送实验室检测。
        鸡肝脏、鸡肉样品：购买农贸市场和超市销售的新鲜鸡肉，2 h内送实验室检测。将样品用无菌生理盐水冲洗掉表面杂质，浸入到75%乙醇中消毒3 min，取出放于无菌滤纸上自然晾干表面水分待检。
        无菌剪刀剪取适量鸡肝脏、鸡肉样品，放入装有50 ml Bolton肉汤的无菌袋中，42 ℃微需氧培养48 h后平板划线分离。鸡肛拭子和酮体涂抹拭子标本直接于42 ℃微需氧培养48 h后进行平板分离。
        参照GB 4789.9—2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》^［5］进行试验。挑取mCCDA上针尖状、水滴样的可疑菌落，接种至哥伦比亚血琼脂平板，42 ℃微需氧培养48 h。取纯化后的菌苔做革兰染色镜检和生化试验。生化鉴定试验有氧化酶、过氧化氢酶、吲哚乙酸酯、马尿酸水解试验。
空肠弯曲菌生化试验结果为氧化酶、过氧化氢酶、吲哚乙酸酯、马尿酸水解试验均阳性；结肠弯曲菌生化试验结果除不水解马尿酸外，其余结果与空肠弯曲菌相同。
        模板制备：取纯培养物加入到含100 μl无菌纯水的EP管中，煮沸10 min，立即冷却，14 000 r/min离心3 min取上清。
        PCR反应体系为5×高保真酶缓冲液10 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液（2.5 mmol/L）4 μl，上、下游引物（20 μmol/L）各0.6 μl，高保真酶0.5 μl，模板5 μl，加超纯水至50 μl。PCR反应条件为98 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃终止。将PCR产物进行毛细管电泳，扩增出16S rRNA和MapA两个目的片段的菌株判定为空肠弯曲菌；扩增出16S rRNA和CeuE两个目的片段的菌株判定为结肠弯曲菌。
        采用K-B纸片法，将纯培养后的分离株制备成0.5麦氏浓度的菌悬液，用无菌棉签蘸取制备好的菌悬液均匀涂布在哥伦比亚血琼脂平板上，放置药敏纸片，各纸片间中心距离为24 mm，距平皿外缘15 mm，42 ℃微需氧培养48 h后测量抑菌圈直径。同时用金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、大肠埃希菌（ATCC 25922）作为质控。
        药敏结果用SPSS 13.0做χ²检验，比较各种抗生素药物耐药率的差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。
        如表2所示，439份标本/样品通过分离鉴定，共有17份检出弯曲菌，总检出率为3.9%（17/439），其中7份为空肠弯曲菌，检出率为1.6% （7/439），10份为结肠弯曲菌，检出率为2.3%（10/439）。空肠弯曲菌仅在鸡酮体涂抹拭子标本和鸡肉样品中检出；结肠弯曲菌除在鸡酮体涂抹拭 子标本中未检出外，其他类别标本/样品中均有检出；空肠弯曲菌在鸡酮体涂抹拭子标本的检出率最高，为8.3%（5/60）；结肠弯曲菌在鸡肉中检出率最高，为3.9%（4/103）。经统计学分析，2种弯曲菌在肉鸡屠宰和市售环节的检出率差异无统计学意义（P>0.05）。
        7株空肠弯曲菌对庆大霉素、链霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、红霉素、氟苯尼考全部敏感，对萘啶酸、左氧氟沙星、环丙沙星、多西环素、四环素、克林霉素表现为不同程度的耐药，见图1。10株结肠弯曲菌对左氧氟沙星、环丙沙星耐药率为100.0%，对其余10种抗生素都有不同程度的耐药，见图2。         空肠弯曲菌对萘啶酸、左氧氟沙星、环丙沙星和四环素的耐药率最高（85.7%，6/7），对克林霉素和多西环素耐药率分别为57.1%（4/7）和42.9%（3/7），对庆大霉素、链霉素、丁胺卡那、阿奇霉素、氟苯尼考等药物全部敏感。结肠弯曲菌株对环丙沙星和左氧氟沙星耐药率最高（100.0%，10/10），其次是萘啶酸、庆大霉素、丁胺卡那、四环素，均为90.0%（9/10），对链霉素和克林霉素的耐药率均为80.0%（8/10），对阿奇霉素和多西环素的耐药率均为50.0%（5/10），对氟苯尼考的耐药率最低为10.0%（1/10），见表3。用确切概率法对耐药结果统计显示，空肠弯曲菌和结肠弯曲菌对氨基糖苷类（庆大霉素、链霉素、丁胺卡那）、大环内酯类
        弯曲菌耐药情况严重，多重耐药（耐3类及以上抗生素）率为70.6%（12/17），空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重耐药率分别为42.9%（3/7）和90.0%（9/10）。17株弯曲菌的耐药情况主要集中在耐4种、10种、6种抗生素，分别占23.5%（4/17）、23.5%（4/17）、17.6%（3/17），其中，空肠弯曲菌中耐4种和6种抗生素的菌株最多，各有3株；结肠弯曲菌中耐10种抗生素的菌株最多，共有4株。
        17株弯曲菌对6类12种抗生素耐药呈11种谱型，其中，屠宰环节分离的7株弯曲菌产生4种耐药谱，优势谱型为萘啶酸-左氧氟沙星-环丙沙星-四环素，占分离株的17.6%（3/17），市售环节分离的10株弯曲菌产生8种耐药谱，优势谱型为萘啶酸-左氧氟沙星-环丙沙星-庆大霉素-链霉素-丁胺卡那-阿奇霉素-红霉素-四环素-克林霉素，占分离株的17.6%（3/17）。各谱型分布见表4。
        近年来，弯曲菌的流行已引起各国广泛关注，发达国家对不同种类样品的弯曲菌进行了危险性评估。
        本次调查结果显示，在肉鸡屠宰厂中弯曲菌检出率为5.3%（7/131），鸡酮体涂抹拭子和肛拭子检出率分别为8.3%（5/60）和2.8%（2/71），低于河南省^［6］屠宰厂的检出率（38.7%和31.1%），也低于南通市^［7］养鸡场成年鸡肛拭子的检出率（21.2%）。通过对比文献中的检验方法发现，河南省在屠宰厂采集的肛拭子标本没有经过Bolton肉汤增菌而是现场直接划板，南通市则是采取荧光定量PCR与GB 4789.9—2014相结合的方式提高检出率。另外，本次调查中石家庄市市售鸡肉和鸡肝脏样品中的弯曲菌检出率为3.2%（10/308），低于袁丹茅等^［8］、乔昕等^［9］和杨毓环等^［10］报道的50%、51%和7.3%的检出率，与文献对比发现，袁丹茅和杨毓环采用《全国食品污染物监测相关实验室操作手册(食源性致病菌部分)》的弯曲菌检验方法，用含有生长促进剂和特定配方抗生素的布氏肉汤增菌。根据本研究结果可以看出：养殖场本身弯曲菌污染率低于其他