砷（As）是环境中普遍存在的有害物质^［1-3］。在阿根廷、澳大利亚、巴基斯坦、智利、中国、印度、墨西哥等国家，地下水和土壤中的砷经常容易超标^［4-5］。砷对人体有较强的生物富集和毒性作用^［6-7］。砷酸盐［As（V）］和亚砷酸盐［As（III）］是无机砷的主要形态，一甲基砷酸（MMAV）和二甲基砷酸（DMAV）是有机砷的主要形态。无机砷对动物的毒性效应已经比较清楚^［8］，已有证据证明无机砷的暴露和肝癌、糖尿病、皮肤病、前列腺癌有关系^［9-12］。对砷的代谢方式研究^［13-16］证明，甲基化是无机砷在动物体内的主要代谢方式。有人还从兔子和猕猴的肝酶提取物中纯化了甲基转移酶证明了无机砷的甲基化是存在的^［17-21］。LI等^［1］比较了无机砷从土壤向猪和老鼠转移的生物活性。而鲜少关于有机砷的报道，因此有机砷和动物健康的关系有待进一步的研究^［22-23］。
为了初步探明有机砷在动物体内的代谢并与无机砷比较，本研究通过大鼠的动物代谢试验，获得大鼠排泄物（粪和尿）、血液、心脏、脑、肝、肺、脾、肾、肌肉等的4种砷含量4 050个数据，以及28 d给药后的肝脏和肾脏的病理分析，比较研究了As（V）、As（III）、MMAV和DMAV在大鼠中的分布、代谢及亚急性毒性效应。
AFS-930原子荧光光度计（北京吉天），高效液相色谱-串联等离子电感耦合质谱仪（美国安捷伦，HPLC-ICP-MS）。
As（V）（Na₂HAsO₄·7H₂O）、DMAV［(CH₃)₂AsO₂Na］均购自美国Sigma，As（III）（NaAsO₂）、MMAV（CH₃AsO₃HNa·1.5H₂O）均购自美国Chem Service，总砷参考物质（GBW07602，中国标准物质中心），苏木素染色剂（福建迈新生物公司），丙氨酸氨基转移酶（GPT）、天门冬氨酸氨基转移酶（GOT）、尿素氮（BUN）和肌酐（Gr）、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，甲醇（优级纯），氩气、氮气（N₂）纯度均≥99.99%。    
用10 mmol/L的HCl溶解配成的1 000 mg/L（以As计，以下所涉及的砷浓度均以As计算）的4种价态的砷溶液，存于4 ℃的避光环境中，使用时用超纯水溶解。   
SPF级SD雄性大鼠（180±20） g和饲料均购自广州中药大学实验动物中心［许可证号：SCXK（粤）2013-0034（No.44005800001963）］。81只大鼠平均分成9组：对照组，As（V）、As（III）、MMAV、DMAV高剂量组，As（V）、As（III）、MMAV、DMAV低剂量组。以As（Ⅲ）的半数致死剂量（14 mg/kg BW）的1/8为高剂量（1.750 mg/kg BW），1/16（0.875 mg/kg BW）为低剂量。大鼠每天称重且每200 g体质量灌胃的砷溶液为1 ml，砷溶液的浓度根据摄入量的要求计算获得。对照组给予同体积的纯水。
分别在灌胃1、14、28 d时采集尿、粪、血液，采样当天灌胃后断食8 h，用代谢笼收集尿和粪标本，断食12 h后在内眦静脉丛取血。测定排泄物及血液的4种不同形态的砷和总砷，血清用于测定GPT、GOT、BUN和Gr，尿液用于测定NAG。灌胃28 d后，经过24 h代谢，将大鼠处死，取心脏、脑、肝、肺、脾、肾、肌肉，称重，测定4种不同形态的砷和总砷的含量。肝脏和肾脏做病理切片^［24-25］。     
动物样品经同等浓度的HNO₃、H₂SO₄、HClO₄消化后用原子荧光光度计测定总砷浓度。0.5 g样品，加入50%甲醇水溶液超声提取30 min，12 750×g 4 ℃离心10 min，重复两次合并上清液，过0.22 μm聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）滤膜，用HPLC-ICP-MS测定其中的As（III）、As（V）、MMAV和DMAV含量。液相色谱柱为Hamilton PRP X-100色谱柱（250 mm×4.1 mm，0.4 μm），流动相为pH=6.0的20 mmol/L （NH₄）₂HPO₄溶液，流速1.25 ml/min，质谱条件参照文献［26-28］。
GPT、GOT、BUN、Gr、NAG采用试剂盒测定。肝脏和肾脏用蒸馏水洗后吸干水分，用4%的多聚甲醛固定，酒精脱水，包埋，切片，烤片，苏木素染色，脱色，在400倍显微镜下拍照。    
大鼠的砷和病理指标数据取6只平行大鼠的平均数，用平均数±标准偏差表示。所有的数据均以鲜重计算。差异分析（ANOVA）采用SPSS 13.0的最小显著性差异（LSD）分析，以P<0.05为差异有统计学意义。拟合曲线采用Sigma Plot完成。    采用高剂量（1.750 mg/kg BW）和低剂量（0.875 mg/kg BW）4种形态的砷灌胃28 d后，在大鼠各个器官、肌肉、粪、尿、血液中的砷含量分布见
图1。经As（III）、As（V）和MMAV处理的大鼠器官和肌肉中均能检测到DMAV［除低剂量As（III）处理的肾以外］，砷主要转化为DMAV保留在大鼠体内。采用As（III）、As（V）和MMAV灌胃处理后的尿液和粪便中均能检测到DMAV和MMAV，不管是保留在体内还是排泄出来，砷在大鼠体内均是甲基化为有机的形态。As（III）处理的大鼠粪便中有As（III），As（V）处理的粪便中有As（III）和As（V），在粪便
    中的形态转化可能是受到肠道微生物的影响造成无机态间存在着转化。DMAV处理的大鼠仅在肝脏、血液、尿液和粪便中发现了DMAV，DMAV的吸收较少代谢较快。高剂量As（III）处理的大鼠血液中DMAV含量高达58.10 mg/L，分别是粪便、尿液、肝、肺、脾、肾、心、脑和肌肉中DMAV含量的43、10、17、11、7、60、63、387和1 162倍。高剂量As（V）处理的大鼠血液中DMAV含量高达50.23 mg/L，分别是粪便、尿液、肝、肺、脾、肾、心、脑和肌肉中DMAV含量的46、8、39、9、4、14、12、1 674和837倍。高剂量MMAV处理的大鼠血液中DMAV含量高达23.85 mg/L，分别是粪便、尿液、肝、肺、脾、肾、心、脑和肌肉中DMAV含量的7、10、114、25、43、30、6、183和596倍。而高剂量DMAV处理的大鼠血液中DMAV含量仅0.34 mg/L，粪便、尿液和肝脏中的DMAV含量分别为3.37、0.35和0.18 mg/L。采用As（III）、As（V）和MMAV处理的大鼠血液中的砷含量是其他部位或者排泄物的4～1 674倍，砷在血液中的分布浓度较高。    
4种形态的砷在大鼠体内的质量代谢平衡图见图2。经灌胃后，82.9%的As（III）、85.1%的As（V）、95.0%的MMAV和96.2%的DMAV通过尿液和粪便排出。不管是有机砷还是无机砷，主要以有机态从尿液中排出，其中73.2%的As（III）、65.7%的As（V）和91.0%的DMAV以DMAV形态通过尿液排出，62.4%的MMAV通过尿液以MMAV和DMAV形式排出。还有32.7%的MMAV通过粪便以MMAV和DMAV形式排出。摄入As（III）、As（V）、MMAV和DMAV后，分别有16.2%、14.1%、4.65%和0.120%保留在血液中，其他部位留存较少。
4种形态的砷经灌胃大鼠1~28 d体内的砷含量动态见图3。从粪便排出砷的情况看，4种形态的砷中除了采用低剂量MMAV灌胃排出的MMAV在粪便中随着灌胃时间延长而增加外，其他在粪便的排出物中砷含量增幅不大。从灌胃第二天开始，4种形态的砷在大鼠的粪便均有DMAV。从尿液排出砷的情况看，4种形态的砷中采用MMAV灌胃排出的MMAV在尿液中随着灌胃时间延长而明显增加。从血液排出砷的情况看，除了给药DMAV后96.2%通过尿液和粪便排出，很少留存在体内组织中，随着As（III）、As（V）和MMAV给药的增加，血液中的DMAV增加，呈积累效应。尿砷可以作为砷急性中毒的生物标志物来检测^［29］，而如果长期摄入砷就会在血液中积累，推荐血液中的砷作为砷慢性中毒的生物标志物来检测^［30］。     
表1为砷的4种形态对大鼠肝脏功能指标的影响。给药1 d后，灌胃砷各组与对照组比较，GPT升高，差异有统计学意义（P＜0.05），砷的4种形态均表现出对肝功能的急性期影响。给药14 d后，与对照组比较，除As（III）和MMAV低剂量组、As（V）高剂量组外，其他组GPT升高差异有统计学意义（P＜0.05）；而对GOT的影响只有As（III）和MMAV高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。给药28 d后，与对照组比较，只有MMAV高剂量组的GPT升高，As（III）和MMAV高剂量组的GOT升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。也就是说，砷的4种形态对肝功能的影响均有急性期效应，As（III）的影响更明显，随着给药时间的延长肝功能有所恢复，但是As（III）和MMAV高剂量组在持续给药28 d后依旧表现出肝毒性。
表2为砷的4种形态对大鼠肾脏功能指标的影响。给药1 d后，无论是高剂量还是低剂量的砷处理，BUN、Cr和NAG与对照组比较均差异无统计学意义（P>0.05），均未表现出明显的砷毒性作用。给药14 d后，与对照组比较，As（III）各剂量组、MMAV各剂量组及As（V）低剂量组Cr含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），As（III）、As（V）和MMAV均已经不同程度地出现毒性作用，而DMAV没有表现出肾毒性。给药28 d后，与对照组比较，除MMAV高剂量组外，其他形态砷剂量组BUN含量升高差异有统计学意义（P＜0.05）。砷的4种形态对大鼠肾脏均表现出积累效应，但是不同形态的砷毒性效应不同，As（III）最先表现出毒性效应且持续积累，其次为MMAV、As（V），DMAV肾毒性最小。     
4种形态的砷分别给药28 d后，大鼠的肝肾病理切片见图4。与对照组比较，各给药组的肝脏组织切片均可见肝细胞水肿，变形；局部可见粒细胞浸润，提示局部出现炎性细胞浸润；给药组各组间差异无统计学意义（P>0.05）。肾脏病理切片与对照组比较，各给药组的肾脏组织切片均可见肾小管上皮细胞水肿，小管变形；部分可见炎细胞浸润，提示局部出现炎性细胞浸润，但各组间差异无统计学意义（P>0.05）。  大鼠分别给药4种形态的砷后，一部分是以原有的形态或者转化为其他形态排出体外，一部分是留存在体内。排出体外的形式比较多样化，分别有82.9%的As（III）、85.1%的As（V）、95.0%的MMAV和96.2%的DMAV通过粪便和尿液排出，73.2%的As（III）、65.7%的As（V）和91.0%的DMAV是在尿液中以DMAV的形态排出，62.4%的MMAV通过尿液以MMAV和DMAV形态排出，32.7%的MMAV通过粪便以MMAV和DMAV的形式排出。保留在体内的均是甲基化为有机态的形式存在。16.2%的As（III）、14.1%的As（V）、4.65%的MMAV和0.120%的DMAV保留在血液中。采用As（III）、As（V）和MMAV处理的大鼠血液中的砷分布浓度较高，含量是其他部位或者排泄物的4～1 674倍。随着As（III）、As（V）和MMAV给药时间的延长，DMAV在血液和尿液中积累，血液中的含量比尿液中高8倍，各形态间的积累规律不同。4种形态的砷对大鼠肝功能、肾功能均有一定影响，对肝功能的影响为急性期效应，As（III）的影响更明显，随着给药时间的延长肝功能有所恢复，但是As（III）和MMAV高剂量组在持续给药28 d后依旧表现出肝毒性。砷对肾功能的影响主要表现为累积效应，但是不同形态的砷毒性效应不同，As（III）最先表现出毒性效应且持续积累，其次为MMAV、As（V），DMAV肾毒性最小。4种形态的砷在大鼠体内的分布、代谢、排泄和肝肾毒性方面均存在不同程度的差异，建议对砷的健康风险应针对不同形态分开研究。