贝类毒素是海洋毒素中对人类健康影响最大的一大类毒素的总称，其主要是由水体中产毒藻类或微生物通过食物链的传递，富集在双壳类、鱼、虾、蟹等水产中，食用这些水产对人体健康有潜在的危害风险。贝类毒素按照中毒症状可分为麻痹性贝类毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）、腹泻性贝类毒素（diarrheticshellfish poisoning，DSP）、记忆缺失性贝类毒素（amnesic shellfish poisoning，ASP）、神经性贝类毒素（neurotoxic shellfish poisoning，NSP），其中PSP的危害最大、分布范围最广、事故发生频率最高^［1］。食入少量PSP即可引起神经系统的疾病，严重时会导致呼吸系统麻痹甚至死亡，由其引发的死亡事件每年超过2 000起，死亡率达到15%，且呈逐年上升趋势（未发表）。目前已分离出20多种PSP，分为石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neo-STX）、膝沟藻毒素（GTX）3大类。PSP是一类神经性毒素，为二代盐，分子量低，白色固体粉末，极性比较高，不挥发，易溶于水、微溶于甲醇和乙醇，不溶于非极性溶剂。在酸性条件下稳定，在碱性条件下可发生氧化，导致毒性降低甚至消失。遇热稳定，不能被人体中的消化酶所破坏^［2］。　　目前国内外检测PSP的方法主要有生物小鼠法^［3-4］、酶联免疫法^［5-6］、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法。生物小鼠法是针对毒素功能而不是毒素结构，只能检测毒素的有无和强弱，且由于小鼠个体差异导致试验重复性差、操作过程繁琐、结果不可靠^［3］；酶联免疫方法只能根据待测物结构表位进行测定，而非针对其结构，由于贝类毒素种类繁多，因此其类似物有干扰作用，导致检测结果假阳性多和对毒素含量测定不准确；HPLC-MS/MS法由于其检测限低、稳定性好、抗干扰能力强，定性定量结果准确等特点，已逐步应用到贝类毒素检测领域^［7-10］。　　目前检测水产品中PSP的液相色谱-质谱联用法中仍存在样品提取回收率较低、基质抑制效应大、同分异构体之间难以单独定性定量等问题，本试验针对以上存在的问题，通过优化样品前处理方法和仪器条件，采用高效液相色谱-串联质谱技术建立一套灵敏度好、准确可靠的双壳类水产品中PSP的检测方法。
样品采自深圳市罗湖区某水产市场，包括扇贝、贻贝、牡蛎、带子、花甲、沙白、生蚝、马刀贝、青蛤9种双壳类水产，共111份样品，于-20 ℃下保存于冰箱。
6410BTriple Quad 高效液相色谱-质谱联用仪［配备1200高效液相色谱仪和电喷雾离子源（ESI），美国Agilent］、TSK-GEL Amide-80色谱柱（2.0 mm×250 mm，5 μm，日本TOSOH）、Envi-Carb SPE小柱（250 mg/3 ml，美国Supelco）、高速低温离心机、GDX-271型全自动固相萃取仪（法国吉尔森）。　　超纯水（美国Millipore Q），乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵均为色谱纯，冰乙酸、氨水均为分析纯，PSP标准品：STX（CAS：35554-08-06）、脱氨甲酰基石房蛤毒素（CAS：58911-04-9，dcSTX）、neo-STX（CAS：64296-20-4）、脱氨甲酰基新石房蛤毒素（CAS：68683-58-9，dcneo-STX）、膝沟藻毒素1（CAS：60748-39-2，GTX1）、膝沟藻毒素2（CAS：60508-89-6，GTX2）、膝沟藻毒素3（CAS：60537-65-7，GTX3）、膝沟藻毒素4（CAS：64296-26-0，GTX4）、N-磺酰氨甲酰基类毒素5（CAS：64296-25-9，GTX5）、脱氨甲酰基膝沟藻毒素2（CAS：86996-87-4，dcGTX2）、脱氨甲酰基膝沟藻毒素3（CAS：87038-53-7，dcGTX3），纯度均>99.0%，均购自加拿大CRMs。
标准储备液：由于购买的PSP标准品均为液体且仅有0.5 ml，且浓度低，用超纯水按一定比例进行稀释，浓度范围为1.0～4.5 μg/ml，0～4 ℃保存。　　标准工作使用液：将样品空白基质与标准储备液按一定比例进行稀释，得到浓度范围在1.0～705.0 ng/ml的标准工作使用液。
用超纯水冲洗净样品上的泥沙，用纸巾吸干表面的水分，称取5 g（精确到0.001 g）样品于50 ml试管中，加入5 ml的1%乙酸水，均质，沸水加热5 min，流水冷却至室温，4 ℃ 4 500 r/min离心10 min，取上清1 ml，加入5 μl氨水，混匀，取500 μl上清液过Supelco ENVI-Carb萃取柱。Supelco ENVI-Carb萃取柱依次用2 ml乙腈、2 ml 20%乙腈水（含0.1%乙酸）、2 ml 0.1%氨水活化，用700 μl超纯水淋洗，抽干，用1 ml 75%乙腈水（含0.25%甲酸）洗脱，过0.22 μm滤膜，上机测定。
质谱：正电喷雾离子源（ESI+）、干燥气温度350 ℃、干燥气流量10.0 L/min、雾化压力38 psi（262 kPa），毛细管电压4 000 V，多重反应监测（MRM）模式，母离子、子离子、碎片电压（FV）、碰撞能量（CE）参数见表1。 色谱：色谱柱为TSK-GEL Amide-80（2.0 mm×250 mm，5 μm）。流动相：A为2 mmol/L甲酸铵-50 mmol/L甲酸水，B为95%乙腈水（含2 mmol/L甲酸铵-50 mmol/L甲酸），流动相流速0.4 ml/min、柱温40 ℃、进样量20 μl，梯度洗脱程序见表2。 由于PSP易溶于弱酸性溶液，在碱性环境中易发生氧化降解，故提取溶液选用乙酸溶液，通过比较不同浓度（0.1%、0.5%、1%、2%）的乙酸溶液对加标样品的提取效果发现：以STX为例说明，乙酸浓度从0.1%上升至1%的过程中，提取回收率从30%增加至70%左右，2%乙酸溶液虽与1%乙酸溶液提取回收率相当，但样品提取液中的杂质增多，不利于消除基质效应和色谱分离，其余10种PSP的提取效果趋势相同，因此采用1%的乙酸溶液作为提取液。通过比较HLB和Supelco ENVI-Carb固相萃取柱的提取效果，发现加标样品中的PSP经HLB柱净化后无出峰且基质效应很大，这与GB/T 5009.213—2016《食品安全国家标准 贝类中麻痹性贝类毒素的测定》^［11］方法中的试验结果似有相悖，可能是由于不同品牌的质谱离子源的抗干扰能力不同所致；采用Supelco ENVI-Carb柱经过PSP加标样品后各个毒素都有出峰，该净化柱可有效吸附目标化合物并去除盐分，降低液相色谱-质谱分析时基质的抑制效应。为了降低基质的抑制效应，同时满足检出限的要求且防止上样量过载，适当减少样品上柱体积，控制在0.5 ml左右；针对PSP中dcneo-STX通过Supelco ENVI-Carb柱净化回收率较低的情况，过柱前样品提取液中加入适量的氨水进行中和（pH=4.0左右），dcneo-STX的回收率由30%提高至50%左右，而对其余10种PSP的回收率影响不大，可能是因为dcneo-STX在弱酸环境中更容易被净化柱所保留；在洗脱液中添加甲酸可明显提高PSP在质谱上的响应值，且能优化峰型。
PSP是强极性化合物，在弱极性C₁8色谱柱上没有保留，难以进行分离检测，而且在11种PSP化合物中GTX1和GTX4、GTX2和GTX3、dcGTX2和dcGTX3之间互为同分异构体，它们的质谱特征碎片几乎一致，如果在色谱上其基线不能分离，将无法单独准确定量。本试验选用亲水性色谱柱并比较了MerckZic-Hilic（150 mm×2.1 mm，5 μm）和TSK-GEL Amide-80（2.0 mm×250 mm，5 μm）两款色谱柱，结果PSP在TSK-GEL Amide-80色谱柱上分离效果较好，且3组同分异构体的基线基本能够分离，能够单独进行定性定量。流动相中加入适当的甲酸铵能够改善峰型，加入甲酸可以提高PSP在质谱上的离子化效率从而提高检测的灵敏度。
11种PSP化合物在ESI+电离形成［M+H］⁺，经过能量碰撞形成特征碎片，选取两组离子对，其中信号响应较强的子离子作为定量离子，信号响应相对较弱的子离子作为辅助定性离子，PSP混合标准溶液总离子（TIC）色谱图及各毒素定量离子MRM色谱图见图1。
取牡蛎样品按1.2.2方法处理后，空白样品与空白基质加标样品进行分析，结果空白牡蛎基质中在PSP出峰位置上无目标化合物母离子出峰（图2），说明空白基质无干扰，方法特异性较好。
用牡蛎空白基质将PSP标准储备液进行稀释，得到浓度范围为8.1 ～705.0 μg/kg的标准工作溶液。以各个毒素的浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归。以PSP在空白牡蛎基质中响应值的3倍信噪比 对应的浓度作为检出限（LOD），以10倍信噪比对应的浓度作为定量限（LOQ）。牡蛎中PSP在8.1～705.0 μg/kg范围内呈良好的线性关系，线性相关系数r>0.995，部分毒素的检出限和定量限低于GB 5009.213—2016^［11］中的值，能够满足双壳类水产中PSP的痕量检测要求，见表3。
　在空白牡蛎中添加适量的PSP混合标准溶液，配制成含PSP高、低2个浓度的质控样品各6份，按照1.2.2处理后进行分析。以当日工作曲线计算各样品中PSP的含量，计算6份加标样品的相对标准偏差（RSD），作为批内精密度。同法重复测定6次，计算RSD值，作为批间精密度，结果见表4。
本课题组从深圳市罗湖区某水产市场中抽采共111份双壳类水产样品，其中扇贝25份、贻贝35份、牡蛎34份、生蚝8份、带子4份、青蛤2份，花甲、沙白、马刀贝各1份。采用本方法进行了PSP检测，其中GTX2有12份检出，检出样品主要为贻贝和扇贝；GTX5有4份检出，检出样品为2份贻贝和2份扇贝；GTX1和dcGTX2均有1份检出，检出样品为扇贝和生蚝，具体检测结果见表5。　　　
本试验采用Supelco ENVI-Carb石墨碳黑柱固相萃取技术对样品中PSP进行净化提取，建立了双壳类水产中PSP的HPLC-MS/MS检测方法，该方法样品前处理基质效应较小、灵敏度高，能够对PSP中各个毒素单独定性定量，为水产中PSP的食品风险监测提供可靠的技术依据。实际样品检测提示双壳类水产中存在PSP的污染状况，其中GTX2含量较多，希望有关监管部门加强监测，以保障消费者的饮食健康。