罗丹明B，又称玫瑰红B、玫瑰精B、罗丹明610和若丹明B等，是一种玫红色的合成荧光染料^［1］。罗丹明B具有价格低廉、色泽红艳、着色能力强等特点^［2］，不法商贩将其用于调味品（辣椒粉、调味油、火锅底料等）的染色^［3］。2008年已被我国禁用，不得在食品中检出^［4］。　　文献报道^［5-11］罗丹明B的检测方法主要为高效(或超高效)液相色谱-荧光检测 ［H(U)PLC-FLR］法和高效(或超高效)液相色谱-串联四极杆质谱 ［H(U)PLC-MS-MS］法，这两种方法均具有较高的灵敏度，而H（U）PLC-FLR具有成本低、方法稳定、干扰信号少的特点，更适于实验室的常规检测^［9-10］。　　调味油中罗丹明B的前处理方法一般采用正己烷提取，中性氧化铝固相萃取柱（Al-N SPE柱）或凝胶色谱系统（GPC）净化^［12-13］，然而GPC净化试剂消耗量大且耗时长，本实验室研究^［14］发现，调味油中罗丹明B经过GPC净化后，随着浓度递增，回收率逐渐降低，而且结果的重现性不理想。有文献^［15］将强阳离子固相萃取（P-SCX SPE）柱及Al-N SPE柱用于辣椒粉和辣椒酱的样品前处理，并进行了比较。本试验采用与文献^［15］不同品牌的SPE柱，对调味油中罗丹明B的两种前处理方法进行了比较：采用酸化乙腈反萃取，混合型阳离子交换（MCX）SPE柱净化；采用含20%丙酮的正己烷提取，Al-N SPE柱净化，为UPLC-FLR法准确测定调味油中罗丹明B提供高效而简便的样品前处理方法。
调味油购于北京市超市，经过质谱确认后样品中无目标化合物；CNCA-16-A10《辣椒油中罗丹明B的测定能力验证》计划中的3份辣椒油能力验证样品由国家认证认可监督管理委员会（CNCA）委托重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供。本实验室获得的样品编号分别为5022、4677和1687。
ACQUITY^TM超高效液相色谱仪（配荧光检测器）、Sep-Pak Al-N SPE柱（2 g/12 ml）、Oasis 混合型阳离子交换MCX SPE柱（60 mg/3 ml）均购自美国Waters，高速离心机，多用途旋涡混合振荡器，超声波清洗仪，Milli-Elix/RiOs超纯水仪。　　罗丹明B（编号：DRE-C16813550，含量＞99.0%，德国Dr. Ehrenstorfer），三氟乙酸（色谱级，美国Sigma），甲酸（纯度＞98%），冰乙酸（分析纯），乙腈、甲醇均为色谱纯。
标准储备液：准确称量适量罗丹明B（按纯度标示折算），用甲醇溶解并定容，配制成1 000 mg/L标准储备液，-20 ℃保存。　　标准工作液：用甲醇-水溶液（50∶50，V/V）逐级稀释标准储备液，现用现配。
酸化乙腈提取、MCX SPE柱净化：称取1.0 g调味油（液态或固态）置于50 ml离心管中，加入2 ml正己烷使样品充分溶解，加入10 ml含0.5%冰乙酸的酸化乙腈提取液，涡旋2 min，超声提取10 min，6 000 r/min离心5 min，收集乙腈层清液；再次加入10 ml提取液，重复提取一次，合并两次提取液，在40 ℃下氮吹至近干，用6 ml乙腈-1%甲酸水溶液（10∶90，V/V）超声溶解，待净化。分别用甲醇、水和0.1 mol/L盐酸溶液活化MCX SPE柱，将提取液缓慢通过SPE柱，加入6 ml甲醇淋洗、抽干；用8 ml 5%氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，在水浴40 ℃下氮吹至近干，最后用甲醇-水溶液（50∶50，V/V）复溶至1 ml，过0.22 μm有机系滤膜，上机测定。　　含20%丙酮的正己烷提取、Al-N SPE柱净化^［15］：称取1.0 g调味油（液态或固态）置于50 ml塑料离心管中，加入10 ml含20%丙酮的正己烷，混合均匀后超声提取10 min，用一次性塑料吸管将上清液取出，重复提取一次，合并上清液，待过柱净化。先用6 ml正己烷活化Al-N SPE柱，上清液全部上样过柱，用10 ml含20%丙酮的正己烷淋洗，流出液弃去；用10 ml含2%氨水的甲醇洗脱，收集洗脱液，在水浴40 ℃下氮气吹至近干，用1 ml 50%甲醇-水溶液（50∶50，V/V）定容，上机测定。
色谱条件：色谱柱Waters ACQUITY BEH C₁8柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温40°C，进样体积10 μl，流速0.3 ml/min。荧光检测器：激发波长E_x=550 nm，发射波长E_m=580 nm。流动相A为甲醇，B为含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见
表1。
用外标法绘制标准曲线，计算样品中罗丹明B的含量，公式为： 其中：X为罗丹明B含量，mg/kg；ρ为上样液中罗丹明B的仪器测定结果，mg/L；V为样液最终定容体积，ml；m为称样量，g。　　采用SPSS 18.0统计学软件对实验室测定值进行统计分析。运用方差齐性检验和独立样本t检验（t-test）用于比较不同净化处理方法的回收率统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
乙腈用于辣椒粉、辣椒酱中罗丹明B的提取已有文献^［14-18］报道，对于调味油基质，大多选择环己烷等非极性溶剂，因为其对调味油具有良好的溶解性。考虑到目标物罗丹明B易溶于水和乙醇，微溶于丙酮，属于中等极性化合物，其在乙腈中的溶解性优于环己烷，因此，采用极性较强的乙腈溶剂从极性弱的油脂中反萃取罗丹明B的同时可去除调味油基质中弱极性的脂溶性物质。将提取液乙腈酸化后，可使罗丹明B的分子带正电，更有利于被乙腈提取，本试验还比较了乙腈中添加不同比例的冰乙酸和三氟乙酸对罗丹明B提取效率的影响。在乙腈提取液中分别加入0.5%、2%的冰乙酸以及0.5%、1%的三氟乙酸，提取效率采用方差同质性检验方法（homogeneity of variance），用Tamhanes’s T₂检验酸化乙腈提取效率的情况。经检验后，未酸化乙腈与其他四组比较，提取效率偏低，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.5%冰乙酸酸化乙腈提取与其他三组酸化乙腈提取效率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；0.5%三氟乙酸酸化乙腈提取与其他三组酸化乙腈提取效率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），即各酸化乙腈组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。所以最终选择价廉且容易获得的0.5%冰乙酸酸化乙腈作为提取液。
将罗丹明B标准储备液用流动相A稀释，分别配制成浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0和500.0 μg/L的标准溶液，以峰面积对质量浓度绘制标准曲线，线性方程为线性范围为5.0～500.0 μg/L，相关系数为0.999 8，方法检出限为0.5 μg/kg(S/N=3)。罗丹明B标准溶液的色谱图和经MCX SPE柱、Al-N SPE柱净化后调味油中罗丹明B的色谱图见图1。
取1.0 g调味油空白样品，分别添加5.0、50.0、200.0 μg/kg三个浓度水平的罗丹明B标准溶液，每个添加水平做6份样品进行平行性试验。回收率结果及相对标准偏差(RSD)见表2。　　经过方差齐性检验后进行独立样本t检验，结果显示：低、中浓度（5.0、50.0 μg/kg）水平加标试验中，酸化乙腈提取、MCX SPE柱净化效果比含20%丙酮的环己烷提取、Al-N SPE柱净化效果好，前者平均回收率在89.3%～97.0%之间，RSD为2.1%～2.9%，低、中浓度检测结果差异有统计学意义（Sig=0.009，P＜0.05；Sig=0.039，P＜0.05）。而高浓度（200.0 μg/kg）加标试验中，两种方法的回收率分别为82.9%和84.2%，差异无统计学意义（Sig=0.16，P＞0.05），RSD为1.5%和2.1%。尽管两种前处理方法均能满足试验要求，但对含量未知的实际样品分析，建议采用酸化乙腈提取、MCX SPE柱净化的方法进行前处理。 为验证本试验所建立MCX SPE柱净化和Al-NSPE柱净化两种前处理方法的有效性，对国家认证认可监督管理委员会实验室能力验证计划发放的3份辣椒油样品采用0.5%冰乙酸-乙腈提取，每份样品平行处理3次，UPLC-FLR定量测定，获得理想结果，见表3、4。
两种前处理方法均可获得较为准确的定量结果。对大批量样品的分析，建议采用酸化乙腈提取、MCX SPE柱净化的方法处理样品，因该方法在酸化乙腈提取目标化合物的同时可除去大量油脂，选用较小容量的MCX柱即可满足净化要求，且MCX对目标化合物的选择性优于Al-N柱，较好的净化效果有利于延长色谱柱的使用寿命、减少质谱的基质抑制、提高定性定量的准确性。
UPLC-FLR测定调味油中罗丹明B的前处理方法，既可用0.5%冰乙酸-乙腈提取、MCX SPE净化，也可用20%丙酮的环己烷提取、Al-N SPE柱净化，前者对目标物的选择性好，在低于200 μg/kg水平下回收率均优于后者，且无需大容量SPE柱，方法准确、可靠，简便易行。