潘琢,郭玉梅,徐保红,秦丽云.营养面条生产过程中克罗诺杆菌污染状况与溯源研究[J].中国食品卫生杂志,2018,30(1):54-58.DOi:10.13590/j.cjfh.2018.01.012
营养面条生产过程中克罗诺杆菌污染状况与溯源研究
(石家庄市疾病预防控制中心，河北 石家庄 050011)
收稿日期：2017-12-15
作者简介：潘琢 男 主管技师 研究方向为食品微生物学 E-mail: zhuo_pan@163.com
通信作者：秦丽云 女 副主任技师 研究方向为食品微生物学 E-mail: qinliyun-@163.com
基金项目：河北省自然基金项目（H2016106028）；石家庄市科学技术研究与发展指导计划项目（41463063）
摘要:目的 调查营养面条生产加工环节中肠杆菌科和克罗诺杆菌的污染状况，对克罗诺杆菌进行溯源研究。方法 采集某营养面条生产企业的生产原料、中间产品、环境、设备、人员和终产品等共101份样品，进行肠杆菌科和克罗诺杆菌检测。利用脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术对克罗诺杆菌进行分子分型和溯源研究。结果 在整个生产过程的样品中，肠杆菌科检出率为53.5%（54/101），其中环境样品的肠杆菌科检出率最高（72.7%，16/22）；克罗诺杆菌检出率为29.7%（30/101），其中终产品的克罗诺杆菌检出率最高（50.0%，5/10）。31株克罗诺杆菌分离株共获得20个PFGE带型，多样性较高，经聚类分析可划分为6个簇型。结论 营养面条生产加工环节中存在克罗诺杆菌的污染状况，该致病菌污染可能与原料污染有关。克罗诺杆菌的污染问题需要引起食品安全管理部门重视，加强生产加工过程监测，制定有效措施予以控制。
关键词:
克罗诺杆菌； 营养面条； 生产过程； 脉冲场凝胶电泳； 食源性致病菌； 污染； 溯源； 食品安全
文章编号：1004-8456(2018)01-0054-05
中图分类号：R155
文献标志码：A
Study on Cronobacter spp. contamination of nutritious noodles and source-tracing of during manufacture process
(Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention, Hebei Shijiazhuang 050011, China)
Abstract:Objective To investigate Cronobacter spp. and Enterobacteriaceae contamination in nutritious noodles manufacture process and study the molecular typing and traceability analysis of Cronobacter spp.Methods Totally 101 samples were collected during the process of production, including raw materials, intermediate products, environment swabs, manufacturing facilities, personnel swabs and final products. Enterobacteriaceae and Cronobacter spp. were detected. And pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) assay was utilized for the molecular typing of Cronobacter spp.Results The isolation rate of Enterobacteriaceae and Cronobacter spp. were 53.5% (54/101) and 29.7% (30/101), respectively. The detection rate of Enterobacteriaceae was the highest in the environment swabs（72.7%，16/22）, and the prevalence of Cronobacter spp. was 50.0%（5/10）in the final products. A high degree of genetic diversity was observed among the 31 isolates with 20 pulse-types dispersed throughout the dendrogram. And the isolates could be grouped into 6 clusters.Conclusion It should be paid more attention that Cronobacter spp. contamination existed in nutritious noodles manufacturing process, which might be due to the contaminated materials. In addition, effective control strategies were supposed to be developed during the manufacturing process.
Key words:
Cronobacter spp; nutritious noodles; manufacturing process; pulsed-field gel electrophoresis; foodborne pathogenic bacteria; pollution; traceability; food safety
克罗诺杆菌是一种条件致病菌，之前被称为阪崎肠杆菌［1］。该菌可引起小肠结肠炎、脑膜炎和菌血症，死亡率高达50%以上，近年来受到人们的高度重视。克罗诺杆菌的主要感染人群为婴幼儿和免疫功能不全的新生儿，也有研究［2］显示克罗诺杆菌也会感染成年人，特别是老年人。克罗诺杆菌分布非常广泛，在多种植物、食品和环境中均有可能存在，但是其污染源还不确切［2-3］。
面条是我国传统食品之一，其主要成分是谷物面粉。而营养面条中还含有多种营养添加物，如谷物类、鸡蛋、蔬菜、肉制品等。由于面条的生产过程并非无菌加工，因此，其产品的质量和食品安全性与原料和生产环节的微生物污染状况直接相关。据报道［4-5］，作为面条的主要原料，小麦、燕麦、玉米等谷物类作物，均有可能被克罗诺杆菌污染。由于营养面条作为一种易消化食品常用于婴幼儿和老年人的膳食，因此，市售营养面条中克罗诺杆菌污染状况需要得到更多关注。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）是致病菌分子分型的“金标准”，该技术已成熟应用于在克罗诺杆菌分型溯源研究中［6］。不过，关于克罗诺杆菌污染的调查和溯源研究多集中在婴幼儿配方奶粉及其生产环节等方面［7-9］。迄今为止，涉及到营养面条克罗诺杆菌污染的研究较少［10］，针对营养面条特别是其生产过程中的克罗诺杆菌污染状况研究鲜有报道。本研究拟采集某营养面条生产企业生产加工过程中各关键环节样品，进行肠杆菌科和克罗诺杆菌检测，并利用PFGE对分离出的菌株进行分子分型和溯源研究，探讨克罗诺杆菌在加工过程中的污染情况并分析可能的污染途径。
食品样品包括原料、中间产品和终产品，均无菌采集每份500 g，环境、人员（手、衣服、鞋底）、仪器设备和工具（维修、清洁）等使用含有10 ml缓冲蛋白胨水（BPW）的海绵拭子涂抹采样（采集面积为1 m2，如涂抹面积不够1 m2则尽量擦拭采集整个物体表面）。
BPW、胰酪大豆胨琼脂（TSA）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)肉汤和结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）均购自北京陆桥技术股份有限公司，海绵采样拭子（含10 ml BPW），阪崎肠杆菌显色琼脂（DFI）培养基（英国Oxoid），API 20E生化鉴定试剂盒（法国梅里埃），SeaKem Gold 琼脂糖（美国Cambrex），限制性内切酶Xba I和蛋白酶K（日本Takara）。
利用Bionumeric version 7.6软件(比利时Applied Maths)，进行PFGE型别分析以及聚类图的制作，数据分析应用DICE系数和非加权配对算数平均（UPGMA）法，条带位置差异容许度2.0%，优化值1.5%。
将菌株的6个优势PFGE簇型在各个生产环节中的分布标示出来，如图2所示，生产过程中原料间环节的簇型最具多样性，共包含有5种PFGE簇型（Crono-1～Crono-5）。食品样品包含4种簇型，海绵拭子样品包含2种簇型。值得注意的是，这些簇型在下游生产加工过程以及终产品中均有发现。此外，簇型Crono-6仅在和面间中间产品和包装间终产品中出现。
营养面条作为婴幼儿食品的一种，具有克罗诺杆菌污染风险。克罗诺杆菌在食品生产中的主要污染途径有两个：一是生产过程中的污染，如使用污染的机器与设备；二是污染原料的使用。在本研究中，克罗诺杆菌PFGE带型具有较高多样性，与国外相关报道［7］一致。利用聚类簇进一步分析PFGE图谱可得，来自于原料、终产品、环境、设备、人员、工具的菌株能够聚为同一个聚类簇（如Crono-3），并且，生产起始环节（原料间）中分离株的PFGE簇型，在接下来的加工过程中及各类产品中都会出现，这就意味着原料污染可能是造成营养面条产品污染的一大因素。
关于原料中的克罗诺杆菌污染，一方面为淀粉类原料的污染，面条的主要原料成分是淀粉类作物，有报告［16］显示该类作物受到克罗诺杆菌污染的风险较大，是造成婴幼儿面条污染的重要因素。在本研究中的所有原料面粉中均分离出克罗诺杆菌。另一方面为营养添加物的污染，为了提高面条的营养需求和增加口味种类，生产中会添加奶粉、谷物粉、蔬菜粉等原料，这些原料也都存在克罗诺杆菌污染的可能［16-17］。本研究在生产原料菠菜粉和西兰花粉中均检出克罗诺杆菌。此外，需要注意的是，在菠菜粉中发现了2种PFGE带型的菌株，提示同一种原料可能会受到多种克罗诺杆菌的污染。
本研究中，一些PFGE簇型在各个环节中的分布缺乏连续性。如Crono-1在原料间、和面间、压面间和干燥间都有检出，但在终产品中并未检出。Crono-3在除干燥间以外的其他生产环节均可检出此簇型菌株。归其原因，一方面可能是采样数量不够造成的，另一方面，面条在干燥间需经过长达2 h的加热干燥（50～60 ℃），该处理环节可能对面条中的克罗诺杆菌有一定杀灭作用。除此之外，在面条生产的中间流程（和面、压面、干燥）中，海绵拭子样品中的菌株簇型种类多于食品样品，这意味着生产过程中环境、设备和人员方面的卫生控制效果不理想，污染状况复杂，因此，在生产中要及时对车间环境、生产设备和工具进行消毒、杀菌。此外，还需针对人员和移动设备制定卫生消毒措施，以限制克罗诺杆菌在各生产区域之间的交叉污染。
总之，营养面条生产加工过程中的肠杆菌科和克罗诺杆菌污染均较为严重，需引起食品安全管理部门关注，有必要进一步加强面条类产品及其生产过程中克罗诺杆菌污染监测，并制定相关措施予以控制，提升食品安全水平。
面条是我国传统食品之一，其主要成分是谷物面粉。而营养面条中还含有多种营养添加物，如谷物类、鸡蛋、蔬菜、肉制品等。由于面条的生产过程并非无菌加工，因此，其产品的质量和食品安全性与原料和生产环节的微生物污染状况直接相关。据报道［4-5］，作为面条的主要原料，小麦、燕麦、玉米等谷物类作物，均有可能被克罗诺杆菌污染。由于营养面条作为一种易消化食品常用于婴幼儿和老年人的膳食，因此，市售营养面条中克罗诺杆菌污染状况需要得到更多关注。
脉冲场凝胶电泳（PFGE）是致病菌分子分型的“金标准”，该技术已成熟应用于在克罗诺杆菌分型溯源研究中［6］。不过，关于克罗诺杆菌污染的调查和溯源研究多集中在婴幼儿配方奶粉及其生产环节等方面［7-9］。迄今为止，涉及到营养面条克罗诺杆菌污染的研究较少［10］，针对营养面条特别是其生产过程中的克罗诺杆菌污染状况研究鲜有报道。本研究拟采集某营养面条生产企业生产加工过程中各关键环节样品，进行肠杆菌科和克罗诺杆菌检测，并利用PFGE对分离出的菌株进行分子分型和溯源研究，探讨克罗诺杆菌在加工过程中的污染情况并分析可能的污染途径。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品采集
2016年10月分2次从某营养面条生产企业采集样品共计101份。样品覆盖营养面条生产的各个环节：生产原料包括小麦面粉、西兰花粉、香菇粉、菠菜粉、黑米粉、薯粉、西红柿粉、牛肉粉等共16份；中间产品包括和面后样品、成型后样品和干燥后样品共计14份；环境样品包括车间地面、运货电梯、墙壁、生产线附近可疑角落等共计22份；人员样品包括和面车间、压面车间、干燥车间和包装车间等地点工人的工作服、手表面、鞋底等样品共计12份；设备样品包括运送推车车轮、和面机、压面机、压面刀、干燥机、传送带、电子天平、包装机等共计20份；工具样品包括维修、清洁工具等共计7份。终产品营养面条共计10份。各类样品与终产品具有批次相关。食品样品包括原料、中间产品和终产品，均无菌采集每份500 g，环境、人员（手、衣服、鞋底）、仪器设备和工具（维修、清洁）等使用含有10 ml缓冲蛋白胨水（BPW）的海绵拭子涂抹采样（采集面积为1 m2，如涂抹面积不够1 m2则尽量擦拭采集整个物体表面）。
1.1.2主要仪器与试剂
旋转式恒温振荡器，CHEF MAPPER脉冲场凝胶电泳仪、GELXR凝胶成像仪均购自美国Bio-Rad。BPW、胰酪大豆胨琼脂（TSA）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)肉汤和结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）均购自北京陆桥技术股份有限公司，海绵采样拭子（含10 ml BPW），阪崎肠杆菌显色琼脂（DFI）培养基（英国Oxoid），API 20E生化鉴定试剂盒（法国梅里埃），SeaKem Gold 琼脂糖（美国Cambrex），限制性内切酶Xba I和蛋白酶K（日本Takara）。
1.2方法
1.2.1肠杆菌科和克罗诺杆菌的检验方法
依据GB 4789.41—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验》［11］规定的方法检测样品中肠杆菌科的污染状况。依据GB 4789.40—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验》［12］规定的方法进行克罗诺杆菌检验和分离。对所有可疑菌株均使用API 20E生化鉴定试剂盒进行鉴定。
1.2.2PFGE
使用PFGE对菌株进行分子分型，采用PulseNet推荐的克罗诺杆菌分型标准方法［13］，沙门菌H9812作为通用标准菌株。菌株使用限制性内切酶Xba I进行酶切。电泳条件：脉冲时间为1.8～25 s，电场强度为6 V/cm，电场角度为120°，电泳时间为19 h。利用Bionumeric version 7.6软件(比利时Applied Maths)，进行PFGE型别分析以及聚类图的制作，数据分析应用DICE系数和非加权配对算数平均（UPGMA）法，条带位置差异容许度2.0%，优化值1.5%。
1.3统计学分析
利用SPSS 19.0对肠杆菌科和克罗诺杆菌的检出率进行卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1菌株分离
如表1所示，101份样品的肠杆菌科检出率（53.5%，54/101）高于克罗诺杆菌检出率（29.7%，30/101），差异具有统计学意义（P＜0.05）。环境样品的肠杆菌科检出率最高（72.7%，16/22），终产品的克罗诺杆菌检出率最高（50.0%，5/10）。此外，本研究共分离出克罗诺杆菌31株（有1份原料中分离出2株克罗诺杆菌）。克罗诺杆菌在食品样品中的检出率为40.0%（16/40），在海绵拭子样品中的检出率为23.0%（14/61）。分离出的菌株均经过API 20E鉴定确认。
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表1肠杆菌科和克罗诺杆菌在生产过程中的污染状况 Table 1Contamination of Enterobacteriaceae and Cronobacter spp. during the manufacturing process |
2.2PFGE聚类分析
克罗诺杆菌的基因组核酸经Xba I酶切后可得到9～20条PFGE条带，分子量在40～1 000 kbp之间。利用Bionumerics软件进行聚类分析显示，克罗诺杆菌分离株的多样性程度较高，共得到20个PFGE带型（如图1所示）。将聚类图中相似系数80%以上的各个菌株归为一簇，可以得到6个优势簇型（Crono-1～Crono-6），每个簇包含2～11株菌。Crono-3为最大的簇，包含11株菌，这些分离株来源于生产过程4个环节（原料、和面、压面、包装）中的6种样品，包括原料、工具、终产品以及环境、设备、人员等。Crono-1是第二大簇，由6株菌株组成，分离自原料、设备和环境样品。Crono-5的5株菌来自食品样品和环境。此外，Crono-4和Crono-2这两簇中的菌株均分离自原料和设备，分别包含3株菌和2株菌。Crono-6中的菌株则来自于中间产品和终产品。
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图131株克罗诺杆菌分离株的PFGE聚类图 Figure 1Dendrogram of PFGE results for total 31 Cronobacter spp. isolates investigated in this study |
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图2营养面条生产加工过程中克罗诺杆菌PFGE优势 聚类簇（Crono-1～Crono-6）的分布状况 Figure 2Distribution of Cronobacter spp. clones (Crono-1 to Crono-6) at various stages of nutritious noodles manufacturing process |
3讨论
本研究中的肠杆菌科检出率（53.5%，54/101）要高于克罗诺杆菌检出率（29.7%，30/101）。肠杆菌科为常见菌，其作为卫生指示菌，常用于卫生状况评价。营养面条生产加工过程中的许多环节上存在肠杆菌科污染，终产品的肠杆菌科检出率为50.0%（5/10），环境样品检出率高达72.7%（16/22），此外，原料、人员、设备样品的检出率都在50.0%以上，高于AKINEDEN等［14］报道的意大利面中肠杆菌科的检出率（38.6%）。此外，克罗诺杆菌在终产品中的检出率高达 50.0%（5/10），高于国外报道［14］的检出率(10.6%），低于国内研究［15］中营养面条克罗诺杆菌污染的检出率(71.4%）。尽管当前国内相关卫生标准中对生产环节肠杆菌科污染未做要求，且对于面条中克罗诺杆菌污染也暂无国家标准规定，但就风险而言不容忽视。营养面条作为婴幼儿食品的一种，具有克罗诺杆菌污染风险。克罗诺杆菌在食品生产中的主要污染途径有两个：一是生产过程中的污染，如使用污染的机器与设备；二是污染原料的使用。在本研究中，克罗诺杆菌PFGE带型具有较高多样性，与国外相关报道［7］一致。利用聚类簇进一步分析PFGE图谱可得，来自于原料、终产品、环境、设备、人员、工具的菌株能够聚为同一个聚类簇（如Crono-3），并且，生产起始环节（原料间）中分离株的PFGE簇型，在接下来的加工过程中及各类产品中都会出现，这就意味着原料污染可能是造成营养面条产品污染的一大因素。
关于原料中的克罗诺杆菌污染，一方面为淀粉类原料的污染，面条的主要原料成分是淀粉类作物，有报告［16］显示该类作物受到克罗诺杆菌污染的风险较大，是造成婴幼儿面条污染的重要因素。在本研究中的所有原料面粉中均分离出克罗诺杆菌。另一方面为营养添加物的污染，为了提高面条的营养需求和增加口味种类，生产中会添加奶粉、谷物粉、蔬菜粉等原料，这些原料也都存在克罗诺杆菌污染的可能［16-17］。本研究在生产原料菠菜粉和西兰花粉中均检出克罗诺杆菌。此外，需要注意的是，在菠菜粉中发现了2种PFGE带型的菌株，提示同一种原料可能会受到多种克罗诺杆菌的污染。
本研究中，一些PFGE簇型在各个环节中的分布缺乏连续性。如Crono-1在原料间、和面间、压面间和干燥间都有检出，但在终产品中并未检出。Crono-3在除干燥间以外的其他生产环节均可检出此簇型菌株。归其原因，一方面可能是采样数量不够造成的，另一方面，面条在干燥间需经过长达2 h的加热干燥（50～60 ℃），该处理环节可能对面条中的克罗诺杆菌有一定杀灭作用。除此之外，在面条生产的中间流程（和面、压面、干燥）中，海绵拭子样品中的菌株簇型种类多于食品样品，这意味着生产过程中环境、设备和人员方面的卫生控制效果不理想，污染状况复杂，因此，在生产中要及时对车间环境、生产设备和工具进行消毒、杀菌。此外，还需针对人员和移动设备制定卫生消毒措施，以限制克罗诺杆菌在各生产区域之间的交叉污染。
总之，营养面条生产加工过程中的肠杆菌科和克罗诺杆菌污染均较为严重，需引起食品安全管理部门关注，有必要进一步加强面条类产品及其生产过程中克罗诺杆菌污染监测，并制定相关措施予以控制，提升食品安全水平。
参考文献
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