诺如病毒（Norovirus，NoV）是全球范围内主要的腹泻病原体之一，每年感染病例数远超沙门菌、弯曲菌等常见致病细菌，在学校、饭店、医院等人员密集场所时有感染暴发的报道^［1-2］。诺如病毒属于杯状病毒科中诺如病毒属的原型代表株，依据病毒衣壳蛋白VP1序列的差异，诺如病毒可分为GI～GV五个基因群，其中引起人类感染的主要是GI和GII群^［3］。    目前诺如病毒的检测方法主要有分子生物学和免疫学方法两大类，其中分子生物学方法中的逆转录-聚合酶链式扩增反应（reversed transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）方法相对较特异、灵敏，在食品污染物检测中应用广泛^［4］。国内和国际诺如病毒检验规范中，均有以RT-PCR原理为基础的标准检验方法^［5-8］。鉴于诺如病毒在食品安全中的重要地位，不同检测试剂公司也开发了一系列针对诺如病毒的检测试剂盒。
    本试验主要参考欧盟ISO/TS 15216《Microbiology of food and animal feed-horizontal method for determi-nation of hepatitis A virus and Norovirus in food using real-time PCR》^［7］方法中的前处理方法，比较罗氏LightMix Kit（以下简称罗氏方法）与SN/T 2626—2010《国境口岸诺如病毒检测方法》^［5］中RT-PCR检测诺如病毒核酸方法（以下简称SN/T方法）对门诊腹泻病人粪便标本和零售贝类样品中诺如病毒检测结果的异同。 
    2014年10月—2015年2月，从中国人民解放军总医院腹泻门诊收集腹泻病人粪便标本217份；2015年10月—2016年2月，从北京市市场采集贝类样品158份，其中：生蚝57份、牡蛎33份、海虹34份、扇贝15份、蛤蜊19份，均用于本方法验证研究。
    Lightcycler 480荧光定量PCR仪(罗氏公司)、普通PCR仪(美国伯乐）、碎花制冰机、高速冷冻离心机、恒温混匀器、电子天平、生物安全柜。
蛋白酶K、recombinant、PCR Grade、High pure viral RNA Kit、Lightcycler 480 RNA Master Hydr-olysis Probes和 LightMix Kit Norovirus均购自罗氏公司，磷酸盐缓冲液，本研究所使用的PAGE级PCR引物由上海英俊公司合成，诺如病毒阳性质控样品（中国食品药品检定研究院），One-step RT-PCR试剂盒（大连宝生物公司）。
    粪便标本中病毒RNA提取： 取约0.1 g软便或0.1 ml稀便标本，加入1 ml磷酸盐溶液（pH=7.4），涡旋振荡混匀，5 000×g离心5 min，取上清200 μl，用High pure viral RNA 提取试剂盒，按使用说明提取病毒RNA，将提取物-80 ℃保存备用。
    贝类样品病毒RNA提取： 参照ISO/TS 15216方法，取5个贝类样品解剖，将分离的消化腺和肠道组织混合均质，称取均质液（2.0±0.1） g，加入2 ml磷酸盐溶液和0.2 mg蛋白酶K，37 ℃振荡1 h后，60 ℃水浴15 min，3 000×g离心5 min，取上清200 μl，用High pure viral RNA提取试剂盒提取RNA，将提取物-80 ℃保存备用。
    SN/T方法： 采用常规RT-PCR方法，上游引物JV12：ATACCACTATGATGCAGATTA，下游引物JV13：TCATCATCACCATAGAAAGAG，其扩增的区域为诺如病毒RNA聚合酶区域，目的片段大小为326 bp。用上述标本和样品中提取的RNA进行诺如病毒检测，如电泳后出现标准中指定的诺如病毒预期产物，且阴性对照未检出，阳性对照检出则判断诺如病毒检测结果为阳性。然后对扩增产物进行序列测定，使用Mega5软件，将测得的序列与GenBank中权威参考诺如病毒序列进行比对分析，判断诺如病毒的具体型别。
    罗氏方法： 采用荧光定量RT-PCR方法，可以检测GI和GII；扩增的区域为ORF1和ORF2链接区域，扩增产物大小为94 bp，使用荧光DNA水解探针，检测阳性则在530 nm通道检测有信号增强；使用MS2噬菌体RNA片段作为内控，对该片段进行扩增，在610 nm通道检测；使用特异性探针与扩增产物片段杂交，在670 nm通道检测，如果有溶解曲线信号出现，则认为是GII型诺如病毒检出，如没有溶解曲线的出现则是GI型诺如病毒检出。由于涉及该公司的技术保密问题，具体的引物和探针的序列没有详细的公开。参照该试剂盒的说明书，对从上述标本和样品中提取的RNA进行诺如病毒检测，如检出诺如病毒，则使用Lightcycler 480SW1.5.1软件对扩增产物进行分析，判断诺如病毒的具体型别，具体判断标准见表1。同时还使用了诺如病毒质控对病毒RNA的提取过程进行监测，如外部质控没有检出，可能在RNA提取过程存在问题。
    使用SPSS 19.0软件中卡方检验程序，对诺如病毒检验结果的差异进行分析。按如下公式，对检验结果一致性进行分析：
    检验结果一致率=［（两种方法均确证为阳性样品数量+两种方法均确证为阴性样品数量）/样品检测总数)］×100% 
    使用Mega5软件对粪便标本和贝类样品SN/T方法成功测序的序列与GenBank中已有的诺如病毒序列进行比对分析，结果见图1。     217份粪便标本中，用罗氏方法检测，诺如病毒阳性率为27.2%（59/217），而用SN/T方法检测，诺如病毒阳性率为17.5%（38/217），两方法结果一致率为85.7%，罗氏方法对诺如病毒的检出率高于SN/T方法，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。