萘啶酸作为第一代喹诺酮类药物，于20世纪60年代广泛用于临床和养殖业，很快便出现了耐药菌株，氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）于20世纪80年代进入临床和养殖行业，通过抑制细菌DNA双螺旋酶（GyrA和GyrB）或拓扑异构酶（parC和parE）达到广谱的杀菌活性，长期用于动物和人类感染疾病的治疗^［1-2］。然而，随着其应用的增多，近十几年来，氟喹诺酮类耐药菌的问题越来越突出，其在全球范围播散对人类健康产生巨大威胁^［3］。目前在我国50%～70%的大肠埃希菌（Escherichia coli）对其耐药，尽管大多数大肠埃希菌为非致病菌株，但部分菌株可以导致严重后果^［4］。
        细菌对氟喹诺酮类药物耐药存在多种耐药机制，主要包括染色体基因突变和编码耐药基因的可移动质粒^［1］。引起高浓度氟喹诺酮耐药机制最常见的为染色体编码耐喹诺酮耐药决定区（quinolone resistance determining regions，QRDRs）发生一个或多个点突变。其次还有外膜蛋白（OmpF）改变或是外排泵（AcrAB-TolC）表达增加等都可以引起细菌对氟喹诺酮类药物或其他药物耐药。除此之外，可移动质粒编码介导喹诺酮耐药（plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR）也在氟喹诺酮耐药中发挥重要作用，包括了Qnr决定子、Aac(6′)-Ib-cr、QepA和OqxAB等耐药元件，它们通过不同方式（结合药物靶点、外排泵）降低细菌对氟喹诺酮类抗生素的敏感性^［1］。
        我国关于耐环丙沙星大肠埃希菌报道多分离自肠道外感染病例（如血液、泌尿系统、腹腔等）^［3］，2014年发布的第一份全球耐药报告显示耐环丙沙星大肠埃希菌已成为重要的食源性致病菌，对人类产生巨大的健康风险和疾病负担^［4］。特别是其具有复杂、可传播的喹诺酮耐药机制，引起全球科学家的关注。本研究针对食品和腹泻患者中分离耐环丙沙星大肠埃希菌进行耐药表型及耐药机制等研究。
        本次研究分析食品和腹泻患者来源的645株大肠埃希菌，其中465株来自2013—2014年全国食品污染物监测网，180株来自于三个省级疾病预防控制中心食源性疾病监测网病人来源大肠埃希菌株。菌株通过API 20E生化鉴定确定为大肠埃希菌，并置50%甘油肉汤中-80 ℃保存。药敏质控标准菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）和肺炎克雷伯杆菌（ATCC 700306）均为本实验室保存。
        Gel Doc XR凝胶成像系统、高通量DNA Engine Tetrad 2 PCR仪、Sub-Cell Model 96 Cell电泳仪均购自美国Bio-Rad，生物安全柜（新加坡ESCO BIOTECH），细菌多点接种仪（日本佐久间），恒温培养箱，小型高速离心机，细菌浊度分析仪，恒温振荡器，纯水仪。
        脑心浸液琼脂（BHA）、脑心浸液肉汤（BHI）均购自北京陆桥技术股份有限公司，Mueller-Hinton肉汤（MHB）、Mueller-Hinton琼脂（MHA）均购自英国Oxoid，庆大霉素（GEN）、氯霉素（CHL）、环丙沙星（CIP）、萘啶酸（NAL）、氨苄西林（AMP）、四环素（TET）、亚胺培南（IMP）、头孢他啶（CAZ）、头孢唑林（CZO）、头孢噻肟（CTX）、复方新诺明（SXT）、替加环素（TGC）、克拉维酸均购自美国Sigma，T载体（pMD18-T Simple Vector）、感受态细胞（E.coli Competent Cells JM109）均购自日本TAKAR。
        用MHA平板（环丙沙星2 μg/ml）进行菌株筛选。挑取在抗生素平板上生长的单菌落，接种于MHA平板，次日挑取单菌落接种于BHA上，37 ℃过夜培养后取部分菌落于含有50%甘油脑心肉汤保菌管中，于-80 ℃保存，用于后续研究。分别取一定量BHA上传代的细菌于双蒸馏水中，100 ℃水煮10 min、12 000×g离心10 min后吸取上清，即得DNA模板。
        参考美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2014版^［6］，使用琼脂稀释法测定大肠埃希菌8类共12种抗生素：青霉素类（氨苄西林）、头孢类（头孢噻肟，头孢他啶，头孢唑林）、头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶/克拉维酸、氨基糖甙类（庆大霉素）、四环素类（四环素，替加环素）、氟喹诺酮类（环丙沙星，萘啶酸）、碳青霉烯类（亚胺培南）、氯霉素类（氯霉素）、叶酸途径抑制剂（复方新诺明）的MIC值，并参照CLSI判断MIC结果是否为耐药或敏感。
        QRDRs基因突变分析^［5］：对1.2.1中筛选出对环丙沙星耐药的大肠埃希菌进行gyrA、gyrB、parC及parE基因PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。阳性扩增片段，送上海英俊公司测序。GenBank下载E.coli K-12（NZ_AKBV01000001.1）的gyrA、gyrB、parC、parE序列，使用Sequencher软件进行序列比对。
        质粒介导PMQR机制分析^［5］：对1.2.1中筛选出对环丙沙星耐药的大肠埃希菌DNA模板进行qepA、qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac（6′）-Ib-cr、oqxAB基因进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。对阳性扩增的产物，送上海英俊公司测序，并将序列在NCBI BLAST上进行比对。
        对1.2.1中筛选出的菌株进行ESBLs blaCTX-M分析^［5］，先确定CTX组别，再用blaCTX-M subgroup进行分型。对阳性扩增产物，将纯化PCR产物连接至T载体，并转至感受态细胞，操作步骤参照试剂盒说明书，送上海英俊公司测序，将反馈的结果在NCBI BLAST上进行比对。
        参照文献［7］，对1.2.1中筛选出的菌株DNA模板使用3个检测基因chuA（279 bp）、yjaA（211 bp）、tspE4（152 bp）将大肠埃希菌分为A、B1、B2和D四类。扩增反应参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后，72 ℃延伸10 min。 
        645株大肠埃希菌中有21株对环丙沙星耐药，阳性率为3.3%。病人和食品中环丙沙星耐药菌株分离率分别为7.2%（13/180）和1.7%（8/465），差异有统计学意义（χ²=12.471，P<0.001）。除对IMP、TGC两种抗生素是完全敏感，对其余10种抗生素均存在不同程度的耐药，均为多重耐药菌株。耐药率最高的是AMP、CTX、CAZ、CZO、CIP、NAL，为100.0%；其次是TET，为95.2%；其余的耐药率依次为SXT（90.4%）、GEN（76.2%）、CHL（52.4%）。共有7种耐药谱，其中最常见的耐药谱为AMP-CAZ-CHL-CIP-CTX-CZO-GEN-SXT-TET（n=9）和AMP-CAZ-CIP-CTX-CZO-GEN-SXT-TET（n=5），见表1。其中对NAL的MIC值均大于512 μg/ml，对CIP的MIC值在2～64 μg/ml之间，具有较高的耐药浓度。结果见图1。
        QRDRs基因分析显示，21株大肠埃希菌分别在gyrA（n=21）、parC（n=20）和parE（n=6）发生1～4个点突变，gyrB没有发生突变。不同菌株发生突变点的数量不同，其中13株菌发生3个位点突变，突变点为gyrA（S83L，D87N/Y/E/G）、parC（S80I）；6株菌发生4个突变点，为gyrA（S83L，D87N）、parC（S80I）、parE（S458A/T）。具有2～4个突变点的菌株具有较高的CIP，其MIC值为4～64 μg/ml，仅具有gyrA（S83L）一个突变点的菌株（P43）CIP的MIC值为2 μg/ml，见图1。

        16株（76.2%，16/21）大肠埃希菌携带了质粒介导的喹诺酮耐药基因，包括oqxA（n=9）、oqxB（n=9）、qnrS（n=5）、aac（6′）-Ib-cr（n=5）和qepA（n=1），6株菌携带1种PMQR，剩余10株菌携带了2种或以上PMQR。其余5株分离株均未检出qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因，见图1。携带PMQR菌株往往具有较高的CIP的MIC值

        21株菌均携带CTX-M型耐药基因。经测序比对CTX-M型菌株具有8个不同的亚型，分别是CTX-M-3、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-24、CTX-M-27、CTX-M-28、CTX-M-65、CTX-M-79，其中CTX-M-14和CTX-M-79型检出数量最多（n=5），见图1。
        21株耐环丙沙星大肠埃希菌菌株中，11株属于A型，5株属于B1型，3株属于D型，2株属于B2型，见图1。
        近年来，多重耐药菌株已成为全球重要的公共卫生问题，特别是喹诺酮耐药的大肠埃希菌，在临床和经济型动物中的分布在世界范围内已有广泛研究。在本研究中，21株食品和腹泻患者来源耐环丙沙星大肠埃希菌分别在gyrA、parC和parE发生1～4个点突变，16株菌携带了质粒介导的喹诺酮耐药基因，包括oqxA、oqxB、qnrS、aac(6′)-Ib-cr和qepA，同时所有菌株均携带了ESBLs基因。
        在肠杆菌科的喹诺酮耐药中，拓扑异构酶的改变（GyrA、GyrB、ParC和ParE），可降低喹诺酮类抗生素对其的亲和力，从而降低微生物对抗生素的敏感性。研究^［8］报道在我国大肠埃希菌最主要染色体编码耐喹诺酮耐药决定区突变点是gyrA（S83L/D87N，263株，87.1%），parC（S80I，233株，77.2%），本研究中的结果与此报道的结果一致。大部分菌株具有3～4个突变位点。除此之外，本次研究中除了在常见gyrA和parC上有突变点以外，有6株菌在parE上也有突变点（见图1）。P43仅有一个突变位点（GyrA S83L）呈现低水平的环丙沙星耐药（2 μg/ml）。
        在一项覆盖全国30家医院耐氟喹诺酮类大肠埃希菌的调查结果^［8］中显示，qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA、oqxAB基因分别占所有菌株的2.7%、24.5%、11.9%、6.3%，其中37.3%菌株至少携带了1种PMQR。本研究中，76.2%（16/21）菌株携带了1种PMQR，具有较高的携带率。
        21株分离株均对三代头孢耐药，使临床上对于此类感染疾病用药大大受到限制^［5］。进一步分析ESBLs编码基因，发现21株分离株携带编码的耐药基因CTX-M呈现多样性，具有8种不同的CTX-M型别，说明这些菌株来源广泛。其中以CTX-M-14（23.8%，5/21）和CTX-M-79（23.8%，5/21）居多，肠道外感染的患者样本中检测的ESBLs大肠埃希菌往往携带CTX-M-14和CTX-M-15型别^［9-10］，本研究中CTX-M-14全部来自于腹泻患者，说明该型别是肠道外和肠道内引起感染大肠埃希菌的主要型别。目前国际上对耐药质粒进化研究方法，主要为质粒分型技术，该方法可以检测肠杆菌科耐药质粒的传播和进化，特别是ESBLs的传播特点分析，是今后需要进一步完善的地方。
        系统发育分析显示，与致病相关的大肠埃希菌往往属于B2型和D型。在本研究中大部分菌株属于A型（52.4%，11/21）和B1型（23.8%，5/21），仅有2株属于B2型（9.5%，2/21），且均来源于腹泻患者的菌株。在一项连续14年教学医院耐环丙沙星大肠埃希菌研究^［3］中发现，38.7%的菌株都属于B2型，且B2型的菌株近几年（2007—2015）已成为优势型别。
        耐环丙沙星大肠埃希菌已成为全球重要的食源性致病菌，特别是其具有复杂、可传播的喹诺酮耐药机制，应引起相关部门的广泛重视。本研究通过对耐药菌株耐药表型及耐药机制等的探索，发现食品和腹泻患者来源的耐环丙沙星大肠埃希菌耐药机制具有多样性，携带多种耐药基因质粒存在潜在的传播可能，对公众健康产生巨大威胁。需进一步开展此类耐药菌株的监测，为评估其对人群的健康风险提供基础数据。