诺如病毒是引起人类急性胃肠炎的主要病原体之一，可感染所有年龄阶段的人群^［1］。2014年AHMED等^［2］发表的一篇系统综述和Meta分析，纳入了48个国家报道的175篇文献，结果发现1/5的急性胃肠炎病例是由诺如病毒感染引起的。美国和欧洲50%以上的急性胃肠炎暴发由诺如病毒所致^［3］。美国每年约有1 900万～2 100万诺如病毒胃肠炎病例，其中170万～190万病例在医院门诊就诊，40万病例在急诊室就诊，5.6万～7.1万例住院治疗，造成严重的疾病负担^［4］。我国是全球15个腹泻病高负担国家之一，腹泻病例中有11.6%检出诺如病毒，因此诺如病毒对我国人群健康的影响不容忽视^［5］。在我国，诺如病毒引起的急性胃肠炎病例呈逐年增长趋势^［6］。2012年以来，诺如病毒已成为我国非细菌性感染性腹泻病暴发的优势病原体（60%～96%），尤其自2014年冬季起，诺如病毒感染暴发疫情大幅增加，2015年1～11月通过突发公共卫生事件管理系统已报告90起，明显高于历年水平^［7］。
        诺如病毒传播途径主要为接触或经食物和水。美国疾病预防控制中心在1996—2000年发布的348次诺如病毒暴发事件中，食物污染、接触传播和饮用水污染导致的病毒感染分别占39%、12%和3%，表明食物污染是诺如病毒传播的最主要途径^［8］。2010年欧盟发生了84起有明显证据的食源性诺如病毒暴发事件，主要涉及到的食物有贝类水产品（25%）、自助餐（22.6%）和水果（9.5%）^［9］。2006—2008年日本和英国发生史上规模最大的诺如病毒疫情暴发，与生食被 诺如病毒污染的贝类相关^［10］，因此，贝类被认为是引起人类诺如病毒感染和腹泻病暴发的高危食品，其中牡蛎被认为是引起消费者感染诺如病毒最危险的食品之一。首先牡蛎本身特有的滤食作用，容易在体内大量富集环境中的诺如病毒，致使牡蛎体内的病毒浓度通常是周围养殖水体中的100～1 000倍^［11］，因此比较容易检测到牡蛎体内的诺如病毒；其次消费者生食牡蛎或食用时加热不彻底均极易感染诺如病毒，引发急性胃肠炎。例如欧盟食品和饲料快速预警系统2000—2010年有关病毒引发的疫情通报^［12］中，91.7%（33/36）的疫情是由诺如病毒引起，其中66.7%（22/33）的疫情是由食用诺如病毒污染的牡蛎引起的；因此，美国、英国、法国、日本等主要沿海国家均对牡蛎中诺如病毒的污染水平进行了系统研究。我国对牡蛎中诺如病毒检测及相关研究起步较晚，缺乏针对牡蛎中诺如病毒的污染水平及定量分析的系统研究及基础数据，无法开展牡蛎中诺如病毒的风险评估。
      通过2015年9月—2016年9月开展北京市市售牡蛎样品中诺如病毒污染水平监测及定量分析，初步了解牡蛎中诺如病毒的污染水平，为开展牡蛎中诺如病毒风险评估及监测提供依据和技术支撑。
       2015年9月—2016年9月从北京某大型海鲜批发市场购买牡蛎样品。
       CFX96荧光PCR仪（美国Bio-Rad）、恒温振荡器、电热恒温水浴箱、普通离心机、台式高速离心机、震荡混匀器。
       蛋白酶K（美国Sigma），病毒提取试剂盒（德国QIAgen），RNA一步定量荧光逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒（美国Life Technologies），门果病毒提取控制试剂盒、诺如病毒GGI定量标准品（批号：140512501）、诺如病毒GGII定量标准品（批号：140512502）均购自法国CeeramTooLs。引物和探针采用国际标准化组织ISO/TS 15216-1《食品中甲肝病毒和诺如病毒real-time RT-PCR检测方法》^［13］推荐的诺如病毒GGI和GGII的引物和探针，其中GGI探针5’端标记六氯荧光素（HEX）荧光集团，3’端标记BHQ1淬灭集团；GGII探针5’端标记羧基荧光素（FAM）荧光集团，3’端标记四甲基若丹明（TAMRA）淬灭集团。引物和探针均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成^［11］。
        样品前处理方法在ISO/TS 15216-1^［13］推荐的双壳贝类样品中诺如病毒提取方法的基础上稍有改动。具体步骤如下：取2～5份独立牡蛎样品的消化腺体，置于无菌平皿内，将消化腺剪碎后混匀，全部放入50 ml离心管，研磨至均质，作为一份混合样品进行检测。称取其中2 g消化腺，置于另一个干净的15 ml离心管中，加入10 μl门果病毒（作为过程控制对照），同时加入2 ml的磷酸盐缓冲液和10 μl 20 mg/ml的蛋白酶K溶液，37 ℃ 280 r/min振荡60 min。取出离心管，60 ℃水浴15 min，室温下3 000 r/min离心5 min，取上清于EP管中，并记录上清液体积，立即提取病毒RNA。
        病毒RNA的提取参照试剂盒操作说明书进行。诺如病毒RNA提取后，应立即检测，或置于-20 ℃冰箱3 d内完成检测。
        将诺如病毒GGI和GGII标准品用无DNA酶和RNA酶的水稀释，配成1×10⁴、1×10³、1×10²和1×10¹ 基因拷贝/μl的标准系列。
        使用RNA一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒，采用双重检测体系同时检测样品中的GGI和GGII基因组诺如病毒。每份样品反应体系为25 μl，其中5×反应预混液5 μl，诺如病毒GGI和GGII上游引物分别加入1.25 μl，GGI和GGII下游引物分别加入2.25 μl，GGI和GGII探针分别加入0.625 μl，酶混合液1.25 μl，去除DNA酶和RNA酶的水5.5 μl，模板RNA 5 μl。反应条件：55 ℃反转录60 min，1个循环；95 ℃预变性5 min，1个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，65 ℃延伸1 min，45个循环。
        阳性样品判断标准：在满足空白对照和阴性对照Ct值均大于40、阳性对照Ct值小于30的条件下，样品Ct值小于35判断为阳性，样品Ct值大于或等于40判断为阴性，样品Ct值在35～40之间（包含35）判断为可疑样品，需要重复检测，如果Ct值仍然在35～40之间，则判断为阳性样品。
        来自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供的诺如病毒阳性粪便标本（GGI和GGII）为阳性对照。磷酸盐缓冲液为阴性对照，按照病毒RNA提取试剂盒的方法，与样品同时进行提取。去除RNA酶和DNA酶的水为空白对照。门果病毒作为过程控制对照。
      诺如病毒GGI和GGII标准系列在1×10¹～1×10⁴ 基因拷贝/μl的范围内有良好的线性关系，最低定量浓度均为1×10¹ 基因拷贝/μl，GGI和GGII对应的Ct值分别为33.04和33.94。GGI标准品的荧光扩增曲线见图1，标准曲线方程为y=36.288-3.193lg（x），R²=0.997，扩增效率为105.7%。GGII标准品的荧光扩增曲线见图1，曲线方程为y=37.434-3.376lg（x），R²=0.999，扩增效率为97.8%。其中y为Ct值，x为标准品拷贝数。注：A为诺如病毒GGI荧光扩增曲线；B为诺如病毒GGII荧光扩增曲线。
图1诺如病毒GGI和GGII荧光扩增曲线
Figure 1PCR amplification curve of Norovirus GGI and GGII
       总共检测356份混合样品（2～5个牡蛎消化腺混合后即为一份混合样品），诺如病毒阳性样品数为57份，阳性率为16.0%。其中仅检出诺如病毒GGI型的阳性样品数为12份，阳性率为3.4%；GGII型的阳性样品数39份，阳性率为11.0%；另外，有6份样品检测到同时携带GGI和GGII型诺如病毒，占样品总数的1.7%，结果见图2和表1。
        对诺如病毒阳性、门果病毒的回收效率在 10%以上的样品进一步定量分析，根据诺如病毒标准曲线计算出每克消化腺携带的诺如病毒基因拷贝数。共对21份诺如病毒阳性样品进行定量分析，其中包括3份GGI型阳性样品和18份GGII型阳性样品，污染浓度在3.7×10³～2.8×10⁵基因拷贝/g（消化腺）之间，结果见表2。 
      诺如病毒是一种重要的食源性病毒，食品中诺如病毒污染水平低，食品组成复杂，含有大量抑制检测的干扰因子，严重影响了食品中诺如病毒检测的灵敏度，因此食品中诺如病毒的检测一直是诺如病毒研究的重点和难点。目前诺如病毒的检测方法主要有电镜法、免疫学法和RT-PCR法。RT-PCR检测方法因其灵敏度高、特异性强，是检测食品中诺如病毒的良好方法^［14］。虽然各个实验室都建立了有效的诺如病毒RT-PCR检测方法，但在病毒核酸提取、引物设计、RT-PCR体系及反应条件等方面没有统一的标准，由此限制了实验室之间方法和结果的通用性和可比性。本研究采用了国际标准化组织推荐的方法^［13］，检测北京市市售牡蛎样品中诺如病毒的污染水平，使检测结果与国际上相关实验室之间的结果具有一定的可比性。
      本研究中，北京市市售牡蛎样品的平均污染水平为16.0%，不同月份牡蛎中诺如病毒检出率存在差异，这与国内外部分研究者的调查结果相符合。SCHAEFFER等^［15］2010—2011年对法国市场上的牡蛎样品进行了调查，从超市购买的82份牡蛎样品中，有14份检出诺如病毒，阳性率为17.1%，其中2010年2月和3月牡蛎样品中诺如病毒阳性率最高。柳淑芳等^［16］对青岛地区3种共546份贝类样品进行检测，牡蛎样品中诺如病毒的检出率为10.1%，白颉等^［17］对东海地区市场内2 955份零售贝类样品进行检测，牡蛎样品的阳性率为11.0%，冬季的检出率明显高于夏季。本研究在筛选阳性样品进行定量分析时，参考了SCHAEFFER等^［15］提出的样品回收效率大于10%，并且Ct值小于39的条件对符合要求的阳性样品进行定量分析。诺如病毒浓度范围在3.7×10³～2.8×10⁵基因拷贝/g（消化腺）之间，这个浓度明显高于LOWTHER等^［18］报道的英国牡蛎中诺如病毒浓度50～2 243基因拷贝/g（消化腺），原因主要有两点，第一是由于本研究所用方法与LOWTHER等所用方法存在差异，最终影响到检测方法的灵敏度。首先是GGI引物和探针存在差异，可能影响到GGI诺如病毒检测的灵敏度。其次是诺如病毒RNA的提取纯化方式不同。本研究所用QIAamp病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA；LOWTHER等^［18］采用NucliSENS小型磁力萃取仪，并配套使用NucliSENS磁性萃取试剂提取病毒RNA。不同的提取方法可能会影响病毒RNA的提取效率及对干扰物质的去除效果，最终影响检测的灵敏度。最后，本研究采用双重检测体系，可同时检测样品中GGI和GGII型诺如病毒，提高了检测效率，但也降低了方法的灵敏度。第二个原因是由于牡蛎养殖环境的不同，本身携带的诺如病毒浓度就存在很大差异。有研究^［19-20］报道，诺如病毒感染剂量为18～2 800个病毒粒子，因此本次检测的牡蛎阳性样品如果加工不当或者生食，引起消费者诺如病毒感染的可能性较高。但是，由于RT-PCR方法不能区分病毒粒子是否具有感染性，所以仅从检测结果分析，可能存在对牡蛎样品中诺如病毒危害性的过高估计。
     本研究对北京市市售牡蛎中诺如病毒的污染率及污染水平进行了初步调查，在试验过程中也存在一些问题，如忽略了每个月采样量的均衡性，因此无法准确反映牡蛎中诺如病毒检出率随时间或季节变化的趋势。在本研究的基础上，还将开展牡蛎中诺如病毒的连续动态污染水平监测，统一每个月的采样量，准确掌握诺如病毒污染水平随季节变化的趋势，及时发布预测预警公告，保障消费者食用安全及身体健康，降低由诺如病毒引起的感染性腹泻和疾病负担。