β-受体激动剂（β-agonists）作为一类临床使用的平喘性药物，在医学或兽医学临床上主要用于扩张支气管和增加肺通气量，可治疗支气管哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等病症^［1］。在生物体内β-受体激动剂具有“再分配效应”，可使营养组分由脂肪组织向肌肉组织转移，能直接导致体内的脂肪分解代谢增强、蛋白质合成增加、明显提高酮体瘦肉率、提高饲料转化率，使得用药个体增重，因而常被一些动物饲养者使用。由于β-受体激动剂在动物体内有较长的残留时间，并且在短期内有较大残留量，可致食用者发生肌肉震颤、行走不稳、心律失常、恶心、晕眩等中毒症状，尤其对特殊人群，如孕妇、老人、体质虚弱者等的影响更加严重，因此各国在动物饲养过程中都严禁使用β-受体激动剂。本研究目标物主要以莱克多巴胺和沙丁胺醇两种最常见的非法添加β-受体激动剂为代表。
        目前，国内外报道的动物源性食品中β-受体激动剂残留的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法^［2-3］、酶联免疫分析（ELISA）^［4］、气相色谱-质谱（GC-MS）法^［5-6］、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法^［7-8］等。高效液相色谱-串联质谱法因具有抗干扰能力好、灵敏度高、确证能力强等优点，已成为β-受体激动剂主要的检测和确证方法。β-受体激动剂检测中常用的样品预处理技术主要有液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、免疫亲和色谱（IAC）以及凝胶渗透色谱（GPC）等方法^［9］。固相萃取（SPE）是当前复杂基质中痕量残留检测最为常用的一种样品预处理净化技术，由于其具有操作快速简单、消耗有机溶剂少、样品回收率高、易于自动化等优点，目前被广泛应用于食品等复杂基体前处理中。本试验在GB/T 22286—2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定 液相色谱串联质谱法》^［10］和SN/T 1924—2011《进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》^［11］两种方法的基础上，通过对预处理方法的优化，采用固相萃取净化对动物源性食品中残留的β-受体激动剂进行高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）进行研究，建立适用于常规检测的预处理方法。
        本试验检测的样品购自昆明市各菜市及超市。
        QTRAP 4500质谱分析仪（美国AB SCIEX）、ultiMate3000高效液相色谱仪（美国Thermo）、GX-274固相萃取自动净化系统（法国Gilson）、高速冷冻离心机、均质器、震荡器、pH仪、氮吹仪等。
        β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶（德国Merck KGaA，1.04114.0002）；LabQuick MCX0603固相萃取柱（60 mg/3 ml）、Agela SC0603固相萃取柱（60 mg/3 ml）均购自青岛普瑞邦生物工程有限公司；莱克多巴胺标准品（SB05-202-2008；100 μg/ml）、沙丁胺醇标准品（SB05-201-2008；100 μg/ml）均购自农业部环境保护科研检测所；内标物：D3-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇均购自加拿大CDN，纯度大于99.0%；乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯；浓氨水、浓盐酸、乙酸铵、乙酸钠、冰乙酸等试剂均为分析纯；去离子水用纯水处理终端机制得。
        乙酸钠-醋酸缓冲液（0.2 mol/L）：称取13.6 g乙酸钠，用500 ml水溶解之后用乙酸调节pH=5.2。 5%氨化乙酸乙酯：吸取50 ml浓氨水，用乙酸乙酯定容至1 000 ml混匀，现配现用。 固相萃取淋洗液：吸取3.3 ml浓盐酸与1 000 ml纯水混合配成浓度为40 mmol/L的盐酸溶液作为淋洗液。 流动相乙酸铵溶液（5 mmol/L）：称取0.39 g乙酸铵，用1 000 ml水溶解，过膜后待用。
        β-受体激动剂混合标准溶液（100.0 μg/L）：沙丁胺醇和莱克多巴胺标准品各取100 μl加入100 ml容量瓶中用甲醇定容至刻度。
        D3-沙丁胺醇、D3-莱克多巴胺（50 μg/mL）内标液：D3-沙丁胺醇、D3-莱克多巴胺各称取5 mg（精确到0.1 mg），分别加入1 ml甲醇溶解，吸取100 μl，用甲醇定容至10 ml。
        β-受体激动剂内标混合液（200 μg/L）：吸取D3-沙丁胺醇内标液、D3-莱克多巴胺内标液各1 ml，用甲醇定容至250 ml。
        200 g样品均质后，取5 g（精确到0.01 g）于具塞试管中，贴上标签，将剩余样品放在-18 ℃冰箱冻藏。
        在样品中加入40 μl β-受体激动剂内标混合液静置10 min，加入15 ml乙酸钠-醋酸缓冲溶液，振荡20 s，加入100 μl β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶液，在37 ℃水浴中水解16 h后取出冷却，9 000 r/min离心10 min，分出上层溶液，用3.0 mol/L盐酸溶液将pH值调节至（2.0±0.1），9 000 r/min离心10 min，分出上清液待净化。
        依次用5 ml水、5 ml甲醇、5 ml水、5 ml盐酸溶液（40 mmol/L）活化平衡MCX及SCX固相萃取柱，然后取5 ml上述上清液至柱内，待样品过柱后，用5 ml水、5 ml甲醇淋洗除杂，真空抽干柱内液体后加入10 ml 5%氨化乙酸乙酯洗脱收集于10 ml具塞试管内，在50 ℃水浴中氮气吹干。先加入0.1 ml甲醇超声溶解残留物，再加入0.9 ml甲醇混匀，过0.22 μm滤膜后待HPLC-MS/MS分析。
        液相色谱条件：色谱柱为Waters BEH C₁₈柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温40 ℃；流速0.2 ml/min；进样体积5 μl；流动相A为乙酸铵溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5 min，5%B；0.5～2.0 min，50%B；2.0～3.0 min，95%B；3.0～5.5 min，95%B；5.5～6.0 min，5%B；6.0～8.0 min，5%B。
        质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压0.5 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂温度400 ℃；莱克多巴胺、沙丁胺醇、D3-莱克多巴胺、D3-沙丁胺醇均为正离子扫描；多反应监测（MRM）；雾化气、气帘气、碰撞气由氮气发生器产生，调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值优化至最优灵敏度；定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量见表1。
        该方法与GB/T 22286—2008^［10］和SN/T 1924—2011^［11］的预处理方法比较，提取样品时减少了有机溶剂的使用，节约了成本，减少了工作量。高氯酸具有较强腐蚀性，为了降低操作风险，确保试验人员安全，本试验在调节pH值时使用盐酸代替高氯酸。
        本方法所检测的样品为牛、羊、猪的肌肉组织和肝脏，样品基质较为复杂，在现有的实验室条件下，选择采用固相萃取净化样品，能有效将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，具有理想的回收率，两种β-受体激动剂平均回收率为105.2%。
        固相萃取的操作既可以手工进行，也可以使用仪器自动化完成。手工固相萃取难以精确控制流速，容易导致液体流干，造成回收率不稳定。操作时必须精神高度集中，尤其是柱预处理（活化）时要特别注意。本试验采用固相萃取自动净化系统，解决了手工过柱步骤繁琐、耗费时间、效率不高以及较难精确控制流速等问题。
        在确定回收率试验时，同时比较了不同厂家生产的阳离子交换树脂柱（MCX和SCX），结果表明两种固相萃取柱都具有较高的回收率，净化效果无明显差别，均可适用于该方法净化样品，结果见表2。但在价格上有较大差距，MCX柱与SCX柱价格分别为1 200和800元，SCX柱性价比更高。
        SHAO等^［12］研究了16种β-受体激动剂中绝大多数物质过柱的酸碱度，确定了最佳过柱酸性条件
        氮吹是样品预处理中常见的浓缩技术，由于人为控制气压，气压过大就会将洗脱液吹溅出试管，造成样品中的物质损失或被污染，影响检测结果。经过重复测验，气压控制在0.1 MPa较为理想。采用旋转蒸发仪和DryVap定量浓缩仪能更好的控制浓缩时的飞溅损失问题，但由于设备价格昂贵，有条件的实验室可采用。
        分别吸取100 μg/L β-受体激动剂混合标准溶液5、10、20、50、100 μl，加入200 μg/L β-受体激动剂内标混合溶液40 μl，用甲醇定容至1.0 ml，制备成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/ml的标准系列溶液（含8 ng/ml的内标溶液），分别注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，按前述仪器条件进行测定，同时采用空白样品中添加目标化合物的方法，3倍信噪比确定2种β-受体激动剂在取样量为5.00 g时的检出限在0.13～0.14 μg/kg，10倍信噪比确定定量限为0.43～0.45 μg/kg，在0.50～1.00 ng/ml范围内响应值（y）与浓度（x）的线性关系良好，相关系数（r）均大于0.999，见表3。
2.7不同基质回收率与精密度
        分3组各取6份猪肝和6份猪肉空白样品，各加入10、20、50 μl β-受体激动剂混合标准溶液，加标水平即为0.2、0.4、1.0 μg/kg，再加入40 μl内标混合液（200 μg/L），按本方法处理后测定回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4。该结果说明在上述试验条件和规范的试验操作下，该预处理方法的回收率和精密度均较好，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》^［13］回收率在60%～120%、精密度30%以内的要求，本方法适用于猪肝和猪肉中β-受体激动剂的定量分析，沙丁胺醇、莱克多巴胺标准MRM色谱图和样品加标MRM色谱图见图1。
        本研究建立了同时测定猪肉、猪肝中β-受体激动剂残留的预处理方法，样品经乙酸钠-醋酸缓冲液提取，MCX（SCX）小柱固相萃取，基质净化效果较好，经HPLC-MS/MS测定后，回收率和精密度较为理想，可用于动物源性食品中β-受体激动剂残留的检测。