诺如病毒是引起腹泻最常见的食源性病毒之一，每年感染人数远超沙门菌等常见致病菌。在美国估计每年由诺如病毒引起的胃肠炎住院人数达56 000～71 000人，死亡人数达570～800人^［1］。诺如病毒为直径27 nm、小圆形的病毒，属于杯状病毒科，诺瓦克病毒属。感染人类的主要为GI和GII型，引起的症状包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛、头痛、发热等，年老体弱的患者症状可能更严重，也有无症状感染者^［2-3］。
        目前，诺如病毒检测方法主要有分子生物学和免疫学方法，其中实时荧光逆转录聚合酶链反应（实时荧光RT-PCR）方法相对较灵敏、特异性高，在食品检测中应用较广泛^［3］。国内常用的检测标准方法不多^［4-6］，各个标准对食品样品前处理方法以及RT-PCR检测方法都有差异。在食品检测中，食品样品的前处理，病毒RNA的提取非常关键^［7-8］。本文主要参考欧盟ISO/TS 15216-1^［6］方法对贝类、蔬菜、浆果、即食海产品等进行前处理，使用罗氏诺如病毒相关检测试剂盒进行病毒RNA提取及实时荧光RT-PCR检测分型。
        虽然目前国内由诺如病毒引起的食物中毒报道很多，但国内有关食品中诺如病毒监测报道较少，并且主要是针对贝类样品的监测^［9-10］。国外对贝类、蔬菜、草莓中诺如病毒的监测均有报道^［11-13］。为保障我国食品安全监管工作的顺利实施，亟需开展针对食品中诺如病毒的主动监测，以阐明我国食品中诺如病毒的污染特征。根据诺如病毒暴发特点，并结合我国食品安全的实际情况，对北京市市场上销售的贝类、即食海产品、蔬菜、浆果进行抽样检测，共计675份，以了解北京市市售食品中诺如病毒的污染情况。
        2014年9月—2015年2月，采集北京市市场销售的贝类食品（牡蛎、贻贝、扇贝、文蛤、毛蚶）、即食海产品（三文鱼、即食虾）、蔬菜（生菜、苗菜）、浆果（蓝莓、草莓）类食品共675份。详细信息见表1。
        Lightcycler 480II荧光定量PCR仪（德国罗氏）、Bio-Bad C1000热循环仪（美国伯乐）、生物安全柜、高速冷冻离心机、恒温混匀器、电子天平、电磨匀浆器、碎花制冰机。
        蛋白酶K PCR grade、High pure viral RNA Kit、Master Hydrolysis Probe、LightMix Kit GI-GII均购自德国罗氏，诺如病毒阳性质控球（中国食品药品检定研究院提供），果胶酶（美国Sigma），牛肉膏（国药集团），磷酸盐（PBS）缓冲液，聚乙二醇（PEG）8000，Tris，NaCl，研磨杵。
        贝类食品样品前处理：取5份贝类样品进行解剖，取其消化腺和肠道用于检测。如果一份样品的消化腺和肠道的总质量不够2.0 g，应适当增加取样量，使得每份样品检验的总质量达到2.0 g。将解剖下的消化腺和肠道放到50 ml小烧杯内，用电磨均质器将消化腺仔细打碎呈糊状。将均质的消化腺分别称取（2.0±0.1）g，加入15 ml离心管中，每管加入2 ml的PBS缓冲液，加入10 μl 20 mg/ml蛋白酶K溶液进行消化，活力为30 U。同批次的样品取1份样品加入诺如病毒阳性质控球，作为外部质控阳性对照。将上述样品于37 ℃摇床，320 r/min振荡1 h，恒温水浴60 ℃，保持15 min。3 000×g离心5 min，取200 ng用于RNA提取。
        蔬菜样品前处理：将生菜和苗菜剪成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm大小，称量25 g，放入带有滤膜均质袋一侧，加入40 ml TGBE buffer（Tris碱12.1 g，甘氨酸3.8 g，牛肉膏10 g，蒸馏水1 000 ml，pH=9.5），其中3份平行加入诺如病毒阳性质控球，室温摇晃约20 min。将均质袋滤膜一侧液体倾入50 ml离心管，4 ℃ 10 000×g离心30 min，将上清转移至另一50 ml离心管中，加入1/4体积的5×PEG/NaCl（PEG8000 500 g，NaCl 87 g，加入450 ml水加热溶解，然后定容至1 000 ml）溶液，4 ℃摇晃60 min。摇晃完毕，4 ℃ 10 000×g离心30 min，弃上清，继续4 ℃ 10 000×g离心5 min压实沉淀。向沉淀加入500 μl PBS缓冲液溶解沉淀。
        水果样品前处理：称量草莓和蓝莓25 g，剪成2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm大小，蓝莓体积较小，不用剪碎。放入带有滤膜均质袋一侧，加入40 ml TGBE缓冲液。同批次的样品中，取1份样品加入诺如病毒阳性质控球作为阳性对照。同时加入30 U的果胶酶（黑曲霉）。室温振荡孵育10 min，使用pH试纸，测量pH值。若pH<9.0，用NaOH调节至9.5，再振荡孵育10 min。每调节一次pH值后，孵育10 min，直至pH>9.0；将流出液倒至离心管中（必要情况下使用2个离心管），（5±3）℃ 10 000×g离心（30±5）min。上清移至新管或瓶，用HCl调节pH=（7.0±0.5）。加入1/4体积的5×PEG/NaCl缓冲液，在（5±3）℃条件下，于振荡孵育器孵育（60±5）min。4 ℃ 10 000×g离心（30±5）min（必要情况下将液体分装于2只离心管）。弃去上层溶液，（5±3）℃ 10 000×g离心（5±1）min以使颗粒紧凑。弃去上层溶液，加入（500±10）μl PBS缓冲液重悬沉淀。如果一份样品分两管离心，则用同样体积PBS缓冲液依次重悬。将重悬液移至新的EP管中，加入（500±10）μl氯仿-丁醇溶液，涡旋混匀，室温孵育5 min。（5±3）℃ 10 000×g离心（15±1） min，小心将水相转移至新管待提取RNA。
        三文鱼样品前处理：参照ISO/TS 15216-1^［6］中蔬菜的诺如病毒富集的方法，由于三文鱼中存在的大量蛋白质会对后续的实时荧光RT-PCR产生抑制，因此加入蛋白酶K去除抑制作用。具体操作过程如下：取样品25 g，剪碎后放入无菌均质袋中（带滤网），加入40 ml TGBE缓冲液。同批次样品中取1份样品，加入诺如病毒阳性质控球，室温60 r/min振荡20 min。将样品于冰上静置30 min，4 ℃ 10 000×g离心30 min。吸取上清液，避开脂肪和离心管底部的沉淀，转入新离心管。加入20 μl的蛋白酶K 37 ℃ 750 r/min离心1 h，再60 ℃ 750 r/min离心15 min。加入1/4体积的5×PEG 溶液，振荡60 s后，于4 ℃ 60 r/min振荡60 min； 4 ℃ 10 000×g离心30 min， 倒掉上清；再于4 ℃ 10 000×g离心5 min；弃上清，加入700 μl PBS缓冲液重悬。
        参照Roche High pure viral RNA Kit试剂盒方法对样品进行提取。在本次检测中使用诺如病毒检测试剂盒及Lightcycler 480II荧光定量PCR仪用于诺如病毒的检测。使用诺如病毒阳性质控球作为外部质控，对病毒RNA的提取过程进行检测，如外部质控没有检出，可能在RNA提取过程存在问题。
        诺如病毒实时荧光RT-PCR反应体系（20 μl）：激活剂1.3 μl，引物和探针1 μl，内对照1 μl，促进剂1 μl，预混液7.4 μl，模板5 μl，水3.3 μl。反应条件：61 ℃逆转录3 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸5 s，共45个循环，溶解曲线，95 ℃预变性30 s，40 ℃变性2 min，85 ℃退火1 s，40 ℃降温30 s。使用PCR仪对诺如病毒样品进行实时荧光RT-PCR扩增，并进行溶解曲线的观察。反应完毕使用Lightcycler 480SW1.5.1进行分析，根据说明书对结果进行判读，判断标准见表2。
        诺如病毒的分型参照罗氏检测方法中的结果判读。同时将诺如病毒阳性样品，使用SN/T 2626—2010《国境口岸诺如病毒检测方法》^［4］对RNA聚合酶区域进行扩增，对获得序列进行测序，根据参考文献［14］于National institute for public health and environment网站使用软件对测序结果进行分析，不能够分析的与美国国家生物技术信息中心（NCBI）的权威序列进行分型比对。
        从2014年9月—2015年2月共对478份贝类样品进行检测，包括281份牡蛎、49份贻贝、30份毛蚶、66份扇贝、52份文蛤，具体检测结果详见表3。
        从2014年12月—2015年2月，共对62份蔬菜、84份浆果进行诺如病毒的检测，具体检测结果详见表4。
        从2015年1～2月，共对27份三文鱼和24份即食虾进行诺如病毒检测，具体检测结果详见表5。         本次诺如病毒的监测贝类阳性样品的区域分布见表6。在本次监测中，阳性样品种类包括：牡蛎、贻贝、扇贝、文蛤、生菜、三文鱼。蔬菜和即食海产品阳性样品的采样地点为北京超市或餐饮企业，由于商家保密原因，部分样品产地不能够确定。其中，2家不同的餐饮单位的1份生菜和1份三文鱼样品检测结果为阳性，但产地不详（见表1）。
        贝类样品中有4份检测为GI型，36份检测为GII型，其中牡蛎中2份GI型，14份GII型；贻贝中1份GI型，21份GII型；扇贝中1份GI型；文蛤1份GII型。
应用SN/T 2626—2010方法对42份罗氏检测方法为阳性的样品进行扩增，其中罗氏检测方法为GI型样品没有扩增成功；在罗氏检测方法为GII型的样品中有28份样品应用SN/T 2626—2010方法扩增且测序成功。对测得的序列，使用National institute for public health and environment网站的软件，同时与NCBIblast中权威序列进行比对，最终确认有27份为 GII.17，1份为GII.12。
        生菜中有1份经罗氏试剂盒方法检出GII型诺如病毒，经SN/T 2626—2010方法扩增后测序成功，于NCBI网站使用Blast软件，与存在的序列进行比对鉴定为Hawaii.calicivirus。
        有1份经罗氏试剂盒方法检出GII型诺如病毒，而使用SN/T 2626—2010方法进行扩增没有成功。 
        2014年9月—2015年2月，共监测675份样品，样品涉及到贝类、即食海产品、浆果、蔬菜等，共有42份阳性样品，总检出率为6.2%。虽然已有报道^［15］诺如病毒的成功培养，但对绝大部分实验室诺如病毒的培养仍然不能实现。目前诺如病毒检测中比较认可的金标准是荧光定量PCR方法。而在实际食品检测中，由于诺如病毒的含量较低，在一些样品中的回收率很低，例如在德国草莓中诺如病毒的调查，病毒的回收率很低在0%～1%之间^［16］，导致诺如病毒检测过程不能保证所有的阳性样品均能检测出诺如病毒。在最终PCR检测中，对假阴性的判断有一定的困难，所以需要在检测时合理的设计检测方法。在本次监测的方法建立时，添加诺如病毒阳性质控球作为外部质控，判断检测方法是否为假阴性，添加空白对照控制假阳性，以保证检测方法可信。
        在所有的检测食品中，牡蛎、贻贝、文蛤、扇贝、生菜及即食海产品中的三文鱼检出诺如病毒，浆果中未检出。其中，生菜样品虽然经罗氏试剂盒方法检出GII型诺如病毒，但是经SN/T 2626—2010方法扩增后测序，于NCBI网站使用Blast软件，与存在的序列进行比对鉴定为Hawaii.calicivirus。贝类食品是诺如病毒污染的主要类型，检出率达8.4%（40/478），即食海产品的检出率为2.0%（1/51），蔬菜的检出率为1.6%（1/62），浆果食品未检出，但是也存在污染的可能性需要加强重视。
        本次监测中诺如病毒的检出以海产品为主，通过对牡蛎的6个月的检测表明，其与季节的关系非常紧密，1、2月份的检出率最高，与文献报道^［17］相符，在贻贝样品中检出率较高。有文献报道^［18］在市场销售的海产品的产地以山东、广东、辽宁为主，此次监测这些产地均有诺如病毒样品检出，表明在近海均存在有诺如病毒污染的情况。
2014年12月—2015年3月，北京市感染性腹泻比前一年多35.6%，达到10 626例，其中29.8%是由诺如病毒引起，比前一年增加了12.9%。在22起暴发事件中有20起是由GII.17引起^［19］。而在本次监测的食品中检测出的诺如病毒也是以GII.17为主。提示食品中GII.17诺如病毒的大量检出与GII.17诺如病毒引起的集中暴发，可能存在一定的相关性。
贝类食品是造成诺如病毒感染腹泻高风险的食品，由于近海污水污染的可能性较大，同时牡蛎、文蛤等贝类食品具有富集诺如病毒的特点，所以建议在贝类生产区域的选择上，优先选择洁净的海域进行生产。而非合格区域生产的海产品不能作为即食海产品食用。加强对餐饮业食品安全监控，防止交叉污染。