副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是我国最主要的食源性致病菌之一，约占细菌性食源性疾病总病例数的7.5%^［1］。由于其嗜盐特性，广泛分布于近海岸海水、海产品及其海底沉积物中，是沿海地区细菌性食源性疾病的首要致病菌。然而，在淡水中也能检测到VP^［2-3］，食源性疾病监测结果^［4］表明，VP也是淡水资源丰富区域的主要食源性致病菌。湖州地处太湖南岸，淡水资源丰富，既往监测结果发现湖州地区水产品和临床腹泻病例中VP检出率均较高。为探讨水产品VP污染与临床腹泻病例间的关联性，比较分析VP在水产品与临床腹泻病例中的流行分布特征，为防治VP提供信息参考。
        水产品：由疾病预防控制中心食品专业采样人员采样，时间跨度2014—2016年，地点包括养殖场、批发市场、农贸市场、超市、网店等，共采集653份水产品样品，其中淡水产品392份，海产品261份，包括虾类、鱼类、甲壳类、软体动物及贝类。临床腹泻病例：收集2014—2016年湖州市食源性疾病监测系统中的8 112例临床腹泻病例，其定义是以腹泻症状为主诉就诊的门诊或住院病例，24 h内排便次数≥3次，粪便性状异常（如稀便、水样便、黏液便或脓血便等）。采集粪便或肛拭子标本进行VP检测。
        7300型荧光定量PCR仪（美国ABI）、台式高速离心机、恒温培养箱。碱性蛋白胨水（APW）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、血平板均购自上海哈灵生物技术有限公司，科玛嘉弧菌显色琼脂（郑州博赛生物技术研究所），API 20E肠道菌试剂鉴定条（法国生物梅里埃），11种O群分群血清（日本生研株式会社），tdh和trh基因检测试剂盒（深圳市生科源技术有限公司）。
        水产品样品用自来水冲洗体表后，用75%酒精棉球擦净，鱼类取鱼鳃和鱼肠，蟹取中心内脏及肉，虾取腹节内肌肉，贝类取全部内容物，无菌操作称取待检样品25 g，放入盛有225 ml无菌碱性蛋白胨水的均质袋中，均质制成10^-1稀释液，37 ℃增菌培养18～24 h。粪便或肛拭子标本直接放入盛有3% NaCl碱性蛋白胨水的试管中，37 ℃增菌培养18～24 h。将上述增菌液分别接种于科玛嘉弧菌显色琼脂平板上，37 ℃培养24 h。挑取可疑菌落，应用API 20E肠道菌试剂鉴定条进行生化鉴定。
        使用11种O抗原血清（O1～O11群）进行分群。先接种一管3% NaCl胰蛋白胨大豆琼脂试管斜面，37 ℃培养24 h，用含3% NaCl的5%甘油溶液冲洗斜面培养物，制成浓厚的菌悬液，121 ℃高压1 h后，4 000 r/min 离心15 min，弃去上层液体，沉淀用生理盐水洗3次，每次4 000 r/min离心15 min，最后一次离心后留少许上层液体，混匀制成菌悬液，进行玻片凝集，观察是否有阳性凝集反应，同时用无菌生理盐水作自凝对照。
        经生化鉴定为阳性样品/标本转种血平板，37 ℃培养24 h，刮取菌落溶于100 μl ddH2O中，100 ℃金属浴15 min后，12 000 r/min离心5 min，其上清液即为DNA模板液。使用单重实时荧光PCR法扩增tdh和trh毒力基因，按照试剂盒说明书操作，反应条件为50 ℃预变性2 min，95 ℃变性3 min，95 ℃退火5 s，55 ℃延伸60 s，40个循环；在55 ℃进行FAM通道荧光检测。
        建立Excel数据库，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。定性资料采用率或构成比描述，用χ²检验或Fisher确切概率法进行统计分析，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
        653份水产品中VP检出率为28.02%（183/653），其中淡水产品的检出率为33.67%（132/392），海产品的检出率为19.54%（51/261），经χ²检验，两者间差异有统计学意义（χ²=14.823，P＜0.001）。在时间分布上，不同月份的VP检出率差异有统计学意义（χ²=113.581，P＜0.001），在2～6月的检出率相对较低，7～10月的检出率相对较高，其中9月的检出率最高，达55.00%（33/66），详见图1。在空间分布上，养殖环节中未有VP检出，但在其他流通环节均有VP检出。在保存方式上，淡水产品的冰鲜保存（66.67%，12/18）与海产品的鲜活保存（37.50%，24/64）的VP检出率最高。在水产品的分类上，淡水产品的虾类（53.85%，21/39）与海产品的贝类（37.50%，15/40）的VP检出率最高，详见表1。
        8 112份临床腹泻病例的粪便或肛拭子标本中VP检出率为4.87%（395/8 112），其中女性为5.41%（220/4 070），男性为4.33%（175/4 042），女性高于男性，差异有统计学意义（χ²=5.079，P<0.05）。
在时间分布上，形成一条单峰流行
        表3显示了湖州市水产品与临床腹泻病例中VP的血清型及毒力基因型分布情况。在血清型分布上，二者基本一致，均以O3血清型为主，其次为O4血清型。在毒力基因型分布上，临床腹泻病例以tdh（ + ）/trh（ + ）为主，占60.51%（239/395），其次为tdh（ + ）/trh（ - ），占32.66%（129/395），而水产品以tdh（ - ）/trh（ - ）为主，占42.08%（77/183）。
        VP是一种嗜盐性细菌，主要通过生食海鲜或食用未经烧熟煮透的海产品感染人类^［5］。然而既往调查^［6］ 显示，VP也可在内陆地区的淡水养殖、流通和餐饮各个环节中检出，内陆多地也时有淡水鱼携带VP的报道^［7-8］，从而表明VP已不仅仅是沿海地区的首要食源性致病菌，也是内陆地区主要的食源性致病菌。尽管VP感染引起的胃肠炎通常是自限性的，但对于免疫低下者可能引发败血症而危及生命^［3］。林云等^［9］研究报道嘉兴市VP疾病负担较重，然而相邻城市的湖州水产品与临床腹泻病例中VP检出率均较高，为更好地开展该地区VP防治工作，本研究比较分析了湖州市水产品与临床腹泻病例中VP流行分布情况。653份水产品中VP检出率为28.02%，与浙江省水产品中30.41%的检出率相近，但淡水产品的检出率（33.67%）高于海产品的检出率（19.54%），这与既往报道VP主要存在于海产品的结论不一致^［7,10］，由于在流通环节中除养殖环节未有VP检出外，其他环节均有检出，且存储方式上海产品的鲜活保存检出率（37.50%）最高，而淡水产品的冰鲜保存检出率（66.67%）最高，因此推测食品间的交叉污染可能是导致淡水产品VP污染更严重的原因，但淡水产品鲜活保存的检出率（33.76%）提示也存在淡水养殖环节直接污染的可能。在时间分布上，7～10月VP检出率相对较高，这与夏季水的温度较高更有利于细菌生长繁殖有关^［11］。在水产品的分类上，淡水产品的虾类VP检出率最高，这与既往研究结果^［11］一致。对于海产品贝类VP检出率最高，其原因与贝类属于滤食性动物有关，容易富集周围环境中的致病性弧菌。8 112份临床腹泻病例的粪便或肛拭子标本中VP的检出率为4.87%，略低于温州市的检出率（5.20%）^［12］，但高于嘉兴市的检出率（2.62%）^［9］，说明湖州市VP疫情严峻。在人群分布上，女性高于男性，年龄主要集中于16～65岁，这与相关报道^［9］一致。在时间分布上，7～9月VP感染率较高，这与水产品中VP检出率的时间分布相一致，且在暴露食品的分类上，食用水产动物及其制品的患者VP检出率高于食用其他食品种类者，说明食用被VP污染的水产品是发病的危险因素，这也进一步说明湖州市水产品污染与VP感染有直接的联系。在VP血清型分布方面，水产品与临床腹泻病例中均以O3血清型为主，其次是O4血清型，这与既往研究关于O3、O4血清型主要存在临床病例而很少分布于水产品的结论不一致^［13-14］，但这也从病原微生物学特征方面佐证了湖州市水产品污染与VP感染间存在着直接的联系。既往调查^［14］显示O3、O4血清型属暴发型菌株，因此应进一步加强水产品中VP的监测。在毒力基因型分布上，临床腹泻病例中以携带毒力基因tdh的菌株为主，而水产品中则以未携带毒力基因的菌株为主，这与相关报道一致^［13,15］，与临床菌株相比，来自环境与食物中的菌株一般很少能够产生耐热直接溶血素（tdh）和（或）耐热相关溶血素（trh）。本研究比较分析了湖州市水产品与临床腹泻病例中VP的流行分布特征，从时间分布、血清型分布及病例暴露食品种类方面均提示湖州市水产品VP污染与临床感染病例间存在着直接关联，因此加强水产品VP的监测对湖州市食源性疾病的防控具有重要意义。本次研究还发现湖州市淡水产品VP污染严重，其具体原因还有待进一步的调查研究。由于本次研究数据来源于常规监测数据，一些信息难以获取，建议以后工作中进一步完善阳性菌株相关信息（如血清型、毒力基因型等）的检测与上报，以更好地指导当地的防控工作。