白僵菌素（beauvericin，BEA）和恩镰孢菌素（enniatins，ENNs）主要是由镰刀菌属的燕麦镰刀菌（F.avenaceum）和木贼镰刀菌（F.equiseti）等的某些菌种侵染小麦、大麦、黑麦和燕麦等谷物后，在潮湿和低温条件下产生的真菌毒素^［1-2］。到目前为止，已经发现了29种ENNs，但食品中最常见的ENNs主要有4种即恩镰孢菌素A（enniatin A，ENA）、恩镰孢菌素A₁（enniatin A₁，ENA₁）、恩镰孢菌素B（enniatin B，ENB）和恩镰孢菌素B₁（enniatin B₁，ENB₁）^［3-4］。据报道^［5-7］，BEA和ENNs具有基因毒性和细胞毒性，可诱导染色体畸变、姊妹染色单体交换和微核形成等。目前，已在西班牙、突尼斯、意大利、日本、伊朗、巴西、摩洛哥、挪威和丹麦等国家的谷物及其制品中检测到这两类毒素^［8-14］。UHLIG等^［13］对2000—2002年挪威产73份燕麦、75份大麦和80份小麦共计228份样品中BEA和4种ENNs（ENA、ENA₁、ENB和ENB₁）的污染调查发现，228份样品中5种毒素均有检出。SRENSEN等^［14］对丹麦2005—2006年收获的80份玉米和玉米青贮饲料中BEA和4种ENNs（ENA、ENA₁、ENB和ENB₁）的污染调查表明，两类样品中4种ENNs的检出率由高到低依次为ENB>ENB₁>ENA₁>ENA。考虑到BEA和ENNs污染的严重性和普遍性，近年来人们对其关注也越来越多。
        基于液液萃取或固相萃取的高效液相色谱（HPLC）配合光电二极管阵列检测器（DAD）的HPLC-DAD法是检测食品中BEA和ENNs常用方法^［15］。但由于单纯的色谱分析方法存在特异性不强、灵敏度不高等特点，其应用越来越受到限制。近年来，基于HPLC与质谱联用技术开发的高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）因结合了色谱优越的分离能力与质谱优越的定性能力，明显地提高了检测的灵敏度和特异性，具有检出限低、能获取待测化合物的分子结构信息、对前处理要求不高等特点，成为目前分析食品中BEA和ENNs的最佳手段^［16-19］。但我国目前尚未建立食品中两类毒素的检测方法，本课题组前期在对目前国际上食品中BEA和ENNs的污染与分析方法的最新研究进行概述的基础上^［19］，提出了采用HPLC-MS/MS同时测定谷物及其制品中BEA和4种ENNs（ENA、ENA₁、ENB和ENB₁）的方法。
        玉米及其制品包括玉米粒、玉米渣和玉米面，小麦及其制品包括小麦粉和挂面，均购自部分省（市）超市及农贸市场。
        QTRAP^TM5500 HPLC-MS/MS（配备有ExionLC系统和QTRAP^TM5500质谱仪，美国AB Sciex）、Sep-Pak Vac C18固相萃取柱（SPE，200 mg，3 ml，美国Waters）、涡旋混合器、圆周式振荡器、低温离心机。
        BEA（BIA-B1238）、ENA（BIA-E1165）、ENA₁（BIA-E1166）、ENB（BIA-E1167）和ENB₁（BIA-E1168）均为固体粉末标准品（纯度均≥97%），均购自澳大利亚Bioaustralis；甲醇、乙腈、醋酸、乙酸铵均为质谱纯，超纯水由本实验室的超纯水仪制备。
        标准储备液：分别称取一定量的BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁固体粉末标准品，用乙腈溶解并定容后混匀，得到ENA标准储备液（5 μg/ml）、ENA₁标准储备液（40 μg/ml）、ENB标准储备液（40 μg/ml）、ENB₁标准储备液（100 μg/ml）和BEA标准储备液（100 μg/ml），-20 ℃下避光保存，备用。
        混合标准储备液：从ENA、ENA₁、ENB、ENB₁和BEA标准储备液中分别移取300、100、100、100 和100 μl 至10 ml容量瓶，乙腈定容至刻度，混匀。制备成ENA为150 μg/L、ENA₁和ENB均为400 μg/L、ENB₁和BEA均为1 000 μg/L的混合标准储备液，4 ℃下避光保存。
        混合标准工作液：从ENA、ENA₁、ENB、ENB₁和BEA标准储备液中分别移取30、10、10、10和10 μl 至10 ml容量瓶，乙腈定容至刻度，混匀，制备成ENA为15 μg/L、ENA₁和ENB均为40 μg/L、ENB₁和BEA均为100 μg/L的混合标准工作液。4 ℃下避光保存，用于标准系列工作溶液的配制。
        标准系列工作溶液：移取一定量混合标准工作液用乙腈按比例稀释，配制成一系列标准工作液，其中ENA浓度为0.005、0.015、0.05、0.15、0.5、1.5、5、15 μg/L；ENA₁和ENB浓度均为0.013、0.04、0.13、0.4、1.33、4.0、13.33和40 μg/L；ENB₁和BEA的浓度均为0.033、0.1、0.33、1.0、3.33、10.0、33.33和100 μg/L。若配制基质匹配标准工作溶液，则将稀释溶剂由乙腈更换为空白基质提取液，各毒素浓度保持不变。
        样品粉碎：（1）散装样品：将玉米及其制品和小麦及其制品用四分法缩分至500 g，如有必要则先用高速粉碎机粉碎，-20 ℃下避光保存备用。（2）定型包装样品：独立包装≤500 g的样品，如有必要粉碎则直接用高速粉碎机粉碎后作为样品，备用；若单个样品的独立包装＞500 g，则先用四分法缩分至500 g，如有必要粉碎则再用高速粉碎机粉碎后作为样品，备用，-20 ℃下避光保存。
        提取：称取5.0 g样品（精确至0.01 g）于50 ml刻度离心管中，加入40 ml样品提取液（乙腈∶水=85∶15，V/V），加盖密封后涡旋混匀30～60 s，180 r/min振荡提取30 min后，室温静置15～20 min；准确移取10 ml上清液于另一50 ml刻度离心管，加入20 ml水进行稀释，加盖密封并涡旋混匀30～60 s，室温静置15～20 min备用。
        净化：取4 ml 最终稀释后的样品提取液全部通过事先依次用3 ml甲醇和3 ml水预先活化的SPE柱，依次用3 ml 10%乙腈水溶液、3 ml 50%乙腈水溶液淋洗并抽干SPE柱。最后用2 ml 90%乙腈水溶液洗脱毒素，抽干SPE柱并收集洗脱液，涡旋混匀后备用。
质谱：选择电喷雾正离子扫描（ESI+）、多反应监测（MRM）模式，驻留时间为200 ms，离子源参数见表1，BEA和4种ENNs的保留时间及MRM参数见表2。
        色谱：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），柱温35 ℃，样品室温度15 ℃，进样体积5 μl，流速0.2 ml/min。流动相A为含2 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～2 min 100%A，2～3 min 100%A～40%A，3～19 min 40%A～30%A，19～21 min 30%A～100%A，20～20.1 min 100%A。
        ESI+条件下，分别考察甲醇-水-醋酸（10∶89∶1，V/V）、2 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相A和甲醇-水-醋酸（97∶2∶1，V/V）、乙腈作为流动相B对BEA和4种ENNs保留时间和质谱信号响应值的影响。
        采用MultiQuant^TM3.0.2软件对每份样品中各毒素色谱峰的峰面积、线性关系、校正曲线、信噪比（S/N）、检出限（LOD）和定量限（LOQ）等进行计算。后续的数据处理包括平均加标回收率、基质抑制或增强效应（基质效应，SSE）、精密度等采用Microsoft Excel 2007进行计算。不同基质中每种毒素的平均加标回收率（R_A）和基质效应分别按照公式（1）和（2）进行计算，LOD和LOQ分别按3倍S/N和10倍S/N进行计算。
    
        BEA和4种ENNs均为环脂肽类真菌毒素，本试验分别考察了ESI+和ESI-条件下BEA和4种ENNs的［M+H］+、［M+Na］+和［M+NH₄］+母离子峰的信号响应值强弱，根据欧盟2002/657/EC指令^［20］对于低分辨率质谱联用检测的规定每种毒素选择两个适宜的子离子，后以三通连接方式将标准品与流动相同时进样，优化离子源参数。经过优化发现，5种毒素在ESI+条件下母离子峰的信号响应值均高于在ESI-条件下母离子峰的信号响应值，ESI+条件下5种毒素均以［M+NH₄］+峰的信号响应值最优，优化后的BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的母离子峰分别为801.4、699.5、685.5、657.5、671.5，其他参数具体见表1和2。
        液相色谱流动相的组成不仅影响BEA和4种ENNs的色谱行为，还会影响BEA和4种ENNs的离子化效率。根据2.1质谱条件优化的结果，ESI+条件下分别考察了甲醇-水-醋酸（10∶89∶1，V/V）和甲醇-水-醋酸（97∶2∶1，V/V）作为流动相与2 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相时对5种真菌毒素质谱信号响应值的影响。因5种毒素［M+NH₄］+峰的信号响应值明显高于［M+H］+和［M+Na］+峰的信号响应值，所以2 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相时5种毒素的信号相应值明显高于甲醇-水-醋酸（10∶89∶1，V/V）和甲醇-水-醋酸（97∶2∶1，V/V）作为流动相时的信号相应值，且2 mmol/L乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相时各毒素色谱峰的峰形更对称，基线信号强度更低(见图1）。因乙酸铵浓度过高会影响色谱柱寿命，所以后续试验中选择2 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相A、乙腈作为流动相B进行洗脱。综合考虑各毒素的分离度、保留时间等方面的影响，确定本试验流动相的流速和梯度洗脱程序。 
        本试验在SPE柱常规操作步骤和已有文献^［9］报道的基础上，重点考察了玉米粒和挂面中两类毒素的提取效率。采用两种方法（1）提取后静置15～20 min和（2）1 400×g低温离心10 min对平均加标回收率的影响。结果发现，振荡提取30 min后温室静置15～20 min与1 400×g低温离心10 min对玉 米粒和挂面样品中毒素的平均加标回收率均差异无统计学意义（P>0.05），具体结果见表3。考虑到大量样品中BEA和4种ENNs的提取时，低温离心会明显延长操作时间并增加操作步骤的复杂性，因此后续试验中选择振荡提取30 min后温室静置15～20 min的方式进行BEA和4种ENNs的提取。
        基质效应是目前采用电喷雾电离分析毒素面临的一个巨大挑战。减少进入质谱系统基质组 分的含量和用合适的方法比如基质匹配标准曲线、标准品添加和同位素内标法对测定结果进行校正是目前常用的校正基质效应的方法。前者因在减少进入质谱系统基质组分含量的同时也降低了目标分析物的含量，且明显提高了目标化合物的LOD和LOQ等越来越不被人们采用。基质匹配标准曲线校正法是目前常用的测定食品中毒素含量时校正基质效应的方法。本试验采用HPLC-MS/MS对玉米及其制品包括玉米粒、玉米渣、玉米面和小麦及其制品包括小麦粉和挂面中BEA和4种ENNs的含量测定时发现，玉米及其制品的基质效应为88.0%～101.5%，小麦及其制品的基质效应为55.8%～61.5%，其中小麦粉的基质抑制效应最明显，为55.8%～61.5%，见表4。
        根据欧盟SANCO方法学验证标准^［21］对所建立的方法进行验证，具体见表5和6。可以看出，玉米粒和玉米面的BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的线
性范围分别为0.03～1 200、0.01～180、0.09～480、0.01～480和0.08～1 200 μg/kg，玉米渣中BEA、 ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的线性范围分别为0.03～400、0.02～60、0.09～160、0.01～160和0.07～ 400 μg/kg。小麦及其制品中BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的线性范围分别为0.02～1 200、0.03～180、0.10～480、0.02～480和0.10～1 200 μg/kg，玉米及其制品和小麦及其制品中5种真菌毒素的LOD范围分别为0.01～0.12和0.02～0.21 μg/kg，LOQ范围分别为0.02～0.44和0.05～0.68 μg/kg，且BEA和4种ENNs在不同基质中的线性关系良好，线性相关系数均>0.99，可满足玉米及其制品和小麦及其制品中5种真菌毒素定量检测的要求。         取不含BEA和ENNs的玉米及其制品和小麦及其制品，分别添加低、中、高3个浓度的BEA和ENNs混合标准溶液，每个加标水平进行3次重复试验，按1.2.2进行样品前处理，加标回收率结果见表7。可以看出，玉米及其制品和小麦及其制品中5种真菌毒素的平均加标回收率范围分别为91.6%～149.7%和100.5%～128.2%，相对标准偏差（RSD）范围分别为0.3%～13.8%和1.2%～13.3%，符合欧盟对食品中真菌毒素定量测定时对回收率及RSD的要求^［22］。
        本试验采用添加低、中和高3个浓度BEA和ENNs样品，按照1.2.2对加标样品中的BEA和
4种ENNs进行提取和净化，同一天不同时间点连续进样5次，同时对这些样品连续测定5 d，分别计算各毒素色谱峰的峰面积的RSD，进行日间和日内精 密度的考察，结果见表8。可以看出，玉米及其制品的日内和日间RSD分别为0.2%～6.9%和1.9%～13.5%，小麦及其制品的日内和日间RSD分别
为0.1%～6.8%和3.9%～13.3%，表明所建方法具有良好的精密度。
        从北京、安徽、宁夏等省（市/自治区）采集市售玉米及其制品19份、小麦及其制品17份对所建立的方法进行验证，结果见表9。可以看出，所测的玉米及其制品中BEA和4种ENNs的污染水平均低于小麦及其制品中BEA和4种ENNs的污染水平。19份玉米及其制品中均检出BEA、ENA、ENA₁和ENB₁，平均含量和中位数分别为0.97和0.18、0.06和0.04、0.21和0.20、0.09和0.08 μg/kg，仅1份玉米样品中检出ENB，检出率为5.3%、含量为0.09 μg/kg。17份小麦及其制品中均检出BEA和4种ENNs，BEA、ENA、ENA₁、ENB和ENB₁的平均含量和中位数分别为3.57和3.38、1.16和0.71、3.64和0.89、14.13和3.68、15.10和5.56 μg/kg，值得注意的是一份来自宁夏的小麦粉样品中ENB和ENB₁的含量高达111.95和71.66 μg/kg，但仍低于SRENSEN等^［14］报道的丹麦2005—2006年产玉米和玉米青贮饲料中ENB和ENB₁的最大污染水平，同时本次测定样品中玉米及其制品和小麦及其制品中BEA和4种ENNs的污染水平也均低于UHLIG等^［13］报道的2000—2002年挪威产燕麦、大麦和小麦中BEA和4种ENNs的污染水平。
        本试验在优化液相色谱条件、质谱条件和样品前处理方法的基础上，对方法的准确性及精密度进行了验证，同时对实际样品中BEA和4种ENNs的含量进行测定，建立了玉米及其制品和小麦及其制品中BEA和4种ENNs含量测定的HPLC-MS/MS检测方法。与现有文献报道的谷物及其制品经乙腈-水-乙酸（79∶20∶1，V/V）一步法提取后直接经HPLC-MS/MS或HPLC检测BEA和4种ENNs的方法比较^［10-11］，该方法具有操作简便、灵敏度高、稳定性好、基质效应弱等特点，适于批量样品中BEA和4种ENNs的定性确证与定量检测，能够满足我国污染物监测中玉米及其制品和小麦及其制品中BEA和4种ENNs含量测定的要求。