目的建立一种用LC-MS/MS快速测定牛奶中6种青霉素类抗生素残留的方法。方法选择青霉素G-D7为内标,样品经乙腈沉淀蛋白,SPE柱净化、浓缩,有效地去除杂质。经高效液相色谱C18柱分离,选用含0·1%甲酸的水和乙腈作流动相,在26min内,在线梯度洗脱将6种青霉素类抗生素得以分离。结果方法检出限为青霉素G0·02ng/ml、青霉素V0·06ng/ml、苯唑西林0·04ng/ml、氯唑西林0·11ng/ml、奈夫西林0·02ng/ml、双氯唑西林0·19ng/ml,在0·2~2·0ng/ml线性范围内,相关系数r为0·991,回收率大于90%,方法精密度为4·87%。结论该方法准确可靠,重复性好,灵敏度高。可适用于牛奶中多组分β-内酰胺类抗生素的确认和准确定量检测,能满足各国对上述β-内酰胺类抗生素的最低检出要求。